奎尼酸是重要的芳香族小分子化合物之一，在医药、食品、化工领域有着广泛的应用。我们将代谢工程技术应用于产奎尼酸基因工程菌的构建。利用大肠杆菌莽草酸途径合成新的代谢物奎尼酸，须在宿主细胞引入异源酶基因扩展代谢途径；串联表达酶基因，同时适量增加不同种属的多个关键酶酶量，改善限速反应；利用同源重组进行基因整合和基因破坏，改造染色体结构定向改变微生物代谢途径；目的是将碳代谢流最大程度的引向奎尼酸生成的方向。 1．大肠杆菌aroG、aroB基因的克隆与表达 分别以大肠杆菌（E.coli）W3110染色体DNA和质粒pG908 DNA为模板，用PCR方法扩增得到了arob基因和抗反馈抑制的aroG基因，序列测定与文献报道一致。用高效原核表达载体pBV220分别实现了3-脱氢奎尼酸合成酶（DQS）和抗反馈抑制的DAHP合成酶（DS）的高效表达，DS具有较高的生物学活性。 2．异源奎尼酸脱氢酶（QDHase）在大肠杆菌中功能性表达 以构巢曲霉菌（A.nidulans）基因组DNA为模板，用PCR方法扩增得到了qutB基因，序列测定与文献报道一致。QutB基因克隆入高效原核表达载体pBV220中，实现了外源奎尼酸脱氢酶在大肠杆菌中的功能性表达。 3．单质粒pBV220多基因串联表达重组子的构建及优化 以不同方式组合，构建了含有各自启动子PRPL或PL的二基因aroG、qutB串联表达重组子四种和三基因aroG、qutB、aroB串联表达重组子二种。六种重组子都实现了目的蛋白的表达，表达产物DS和QDHase酶活性有不同程度的提高，其中pBV-PRPL-qutB-PL-aroG串联表达重组子表达产物二种酶活性DS和ODHase都比较高，是优化的重组子。 4．构建宿主菌基因精确定位突变株31BK（aroD::aroBKanr） 为了改变代谢途径脱氢奎尼酸（DHQ）分支点上的代谢流量，使之充分流向目的产物奎尼酸合成方向，利用基因打靶技术构建了31884宿主菌aroD基因精确定位插入突变体，使DHQ脱水酶（DHQase）失活，阻断了碳代谢流流向芳香氨基酸生成的方向，同时用同源重组的方法将aroB基因定位整合入染色体上，解除了限速酶对碳代谢流通过共同途径到达DHQ的阻遏影响，并减轻代谢负担。 5．工程菌摇瓶发酵产酸初步观察 初步探索了奎尼酸工程菌在M9积累培养基中的发酵产酸条件，结果表明工程菌经直接发酵由葡萄糖产生了奎尼酸，但尚须进一步优化发酵条件提高产酸率。 总之，我们成功地实现了转化脱氢奎尼酸生成奎尼酸的异源酶在宿主菌中的功能性表达；构建了将碳代谢流引向奎尼酸合成方向的串联表达重组子；获得了阻断莽草酸途径碳流进入芳香氨基酸生成方向，并能积累奎尼酸合成底物脱氢奎尼酸的宿主菌突变体；构建的工程菌经发酵由葡糖糖产生了奎尼酸。