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研究目的本研究从体外实验探讨糖络宁对高糖培养的大鼠背根神经元细胞miR-200a及氧化应激的影响,以部分阐明中药糖络宁用于临床治疗糖尿病周围神经病变的可能作用机制。研究方法SPF级SD大鼠灌胃10天制备糖络宁含药血清及大鼠正常血清。提取并鉴定大鼠背根神经元神经节(DRGn)细胞。采用不同葡萄糖浓度(50 mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L)、不同浓度糖络宁含药血清(2.5%、5%、10%、20%、30%)培养DRGn细胞,通过CCK-8法检测细胞活性,确定最佳高糖浓度及最佳糖络宁含药血清浓度;运用荧光探针技术检测DRGn细胞中的ROS水平,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力,硫代巴比妥法检测MDA含量;采用实时荧光定量PCR技术检测DRGn细胞中miR-200a、PI3K的基因表达水平;通过Western Blot技术检测DRGn细胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的蛋白表达水平。研究结果1.不同浓度葡萄糖及糖络宁含药血清对DRGn细胞活性的影响随着葡萄糖浓度的增加,DRGn细胞活性显著下降,有统计学差异(P<0.01);50 mmol/L葡萄糖浓度组与75 mmol/L葡萄糖浓度组、75 mmol/L葡萄糖浓度组与100 mmol/L葡萄糖浓度组相比细胞活性均显著下降,有统计学差异(P<0.01)。与24 h相比,各葡萄糖浓度组DRGn在48 h细胞活性均明显下降,有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。随着糖络宁含药血清浓度的增加,DRGn细胞活性呈现先升高后下降的趋势,在糖络宁含药血清浓度为10%时细胞活力最大。其中2.5%浓度组与5%浓度组相比细胞活力无统计学差异(P>0.05),5%浓度组与10%浓度组相比、10%浓度组与20%浓度组相比、20%浓度组与30%浓度组相比细胞活力均有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。与24 h相比,同一浓度糖络宁含药血清干预下的DRGn在48h的细胞活性均有所下降,10%糖络宁含药血清干预下细胞活性下降有统计学差异(P<0.05),其余糖络宁含药血清干预下细胞活性下降无统计学差异(P>0.05)。2.糖络宁对高糖培养下DRGn细胞氧化应激水平的影响与正常组相比,高糖组DRGn细胞中ROS、MDA含量显著增高(P<0.01),SOD活力显著下降(P<0.01);与高糖组相比,糖络宁组各组DRGn细胞中ROS、MDA含量显著下降(P<0.01),SOD活力显著增高(P<0.01)。3.糖络宁对高糖培养下DRGn细胞中miR-200a mRNA、PI3K mRNA表达水平的影响与正常组相比,高糖组DRGn细胞中miR-200amRNA值显著增高(P<0.01)、PI3K mRNA值显著降低(P<0.01);与高糖组相比,糖络宁组各组DRGn细胞中miR-200a mRNA值显著降低(P<0.01)、PI3K mRNA值显著增高(P<0.01)。4.糖络宁对高糖培养下DRGn细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平的影响与正常组相比,高糖组 PI3K、p-PI3K、p-PI3K/PI3K、p-AKT、p-AKT/AKT 蛋白表达水平均显著降低(P<0.01);与高糖组相比,糖络宁组各组PI3K、p-PI3K、p-PI3K/PI3K、p-AKT、p-AKT/AKT蛋白表达水平均显著增高(P<0.01)。结论1.糖络宁可以改善高糖环境下DRGn细胞的氧化应激水平;2.糖络宁改善高糖培养下的DRGn细胞中氧化应激水平可能是通过调控miR-200a及PI3K/AKT信号通路实现的。