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背景全球2型糖尿病人群日益增多,已成为世界范围性的健康问题和经济负担。糖尿病对人类的危害主要在于各种并发症带来的伤残,而以大血管和微血管病变为主的慢性并发症带来的危害最大。在糖尿病血管病变发展过程中,糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)的加速形成及其在血管组织中的大量聚集发挥着重要作用. AGEs不仅通过与蛋白质发生交联,改变蛋白质结构和功能,影响脂质代谢并修饰核酸直接影响细胞和组织的功能,而且也可与组织细胞表面AGEs的特异性受体结合,激动细胞内信号转导通路,导致血管疾病发生、发展。血管内皮细胞是血管腔面的一层半选择性通透屏障,血液和组织中物质交换必须通过血管内皮细胞层选择性的进行,因此维持其形态完整和功能正常至关重要。AGEs蓄积、氧化应激、炎症反应等因素导致的血管内皮细胞损伤是糖尿病大血管病变的始动环节,随之而来的是血管内皮屏障功能受损,表现为内皮细胞收缩性增加和细胞间连接结构破坏,内皮通透性增加,其中细胞收缩主要和肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC)磷酸化介导的细胞骨架重排密切相关。胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1, GLP-1)是肠道L细胞分泌的一种多肽类激素,除调节葡萄糖稳态外,在心血管系统中发挥着潜在的生物学功能。研究报道GLP-1可以通过抑制氧化应激、炎症反应等从而对血管内皮舒张功能发挥保护作用,然而GLP-1对糖尿病血管内皮屏障功能是否产生影响,机制如何,目前少见报道。目的在整体水平研究GLP-1对2型糖尿病大鼠胸主动脉内膜通透性的影响,以及动脉壁MLC及上游RAGE/Rho/ROCK信号通路是否为GLP-1作用靶点。在细胞水平探明GLP-1对AGEs孵育的血管内皮细胞骨架结构的影响及其与MLC磷酸化相关的分子机制。方法1.采用高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素腹腔注射复制2型糖尿病大鼠模型,给予西格列汀(10mg/kg/d和30mg/kg/d)干预12周。酶法、放免法和Elisa法检测血清学指标,电镜和HE染色进行主动脉形态学观察,离体动脉环实验检测动脉内皮舒张功能,大分子荧光染料渗透法检测动脉内膜通透性,免疫组织化学法和Western blot法检测GLP-1R、RAGE、ROCK、MYPT、MLCK和MLC蛋白的表达和磷酸化水平变化。2.体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),采用GLP-1、GLP-1受体拮抗剂Exendin(9-39)、RAGE阻断性抗体Anti-RAGE IgG、腺苷酸环化酶激活剂Forskolin、cAMP抑制剂SQ22536、PKA抑制剂H89、 Rho/ROCK激动剂LPA和抑制剂Fasudil分别或组合干预,采用荧光染色激光共聚焦观察肌动蛋白(F-actin)分布变化,通过G--LA试剂盒检测RhoA活性,Western blot法和免疫荧光法检测GLP-1R, RAGE、PKA、ROCK、MYPT和MLC蛋白的表达和磷酸化水平变化以探讨GLP-1是否通过GLP-1受体途径激动cAMP/PKA信号通路从而抑制Rho/ROCK介导的MLC磷酸化,从而对内皮细胞骨架排列产生影响。结果：1.成功复制2型糖尿病大鼠模型,模型鼠血清空腹血糖、血脂、胰岛素抵抗水平、内皮素显著增加,体重、血浆GLP-1和血清一氧化氮水平显著降低,不同剂量西格列汀干预12周后空腹血糖、胰岛素抵抗水平和内皮素水平不同程度降低,体重、血浆GLP-1和血清一氧化氮水平不同程度提高,但血脂无显著变化。2.2型糖尿病大鼠胸主动脉内皮舒张功能显著减退,内皮细胞间间隙和内膜通透性显著增加,而大剂量西格列汀干预12周后主动脉内皮舒张功能显著提高,内皮细胞间间隙和内膜通透性不同程度的减小。3.2型糖尿病大鼠主动脉GLP-1R表达水平显著下降,而RAGE、ROCK、MLCK表达和MYPT、MLC磷酸化水平及RhoA活性显著上调。不同剂量西格列汀干预12周后不同程度的上调GLP-1R表达水平,并下调RAGE、ROCK、MLCK表达和MYPT、 MLC磷酸化水平及RhoA活性。4.正常内皮细胞骨架F-actin主要分布在细胞周边、胞膜内侧,呈网状分布,靠近细胞连接处呈细丝状排列,线条完整连续,细胞中央应力纤维不明显。给予200mg／1的AGEs刺激HUVECs单层24h,细胞骨架F-actin外周致密带边缘变的粗糙不整、排列较紊乱,细胞边界己难以辨认,F-actin重组,从细胞周边向细胞中心转移并成平行束样堆积、增厚,细胞中央应力纤维形成。Anti-RAGE IgG、Forskolin、Fasudil、 GLP-1能不同程度的恢复F-actin分布,而GLP-1的作用可被Exendin (9-39)、SQ22536、H89和LPA显著减弱。5. AGEs显著上调HUVECs的RAGE、ROCK、MLCK表达和MYPT、MLC磷酸化水平及RhoA活性,下调GLP-1R表达。6. Anti-RAGE IgG可下调AGEs刺激的HUVECs的RAGE、ROCK表达和MYPT、MLC磷酸化水平及RhoA活性,上调GLP-1R表达水平。7. Forskolin可下调AGEs刺激的HUVECs的RAGE、ROCK表达和MYPT、MLC磷酸化水平及RhoA活性。8. Fasudil可下调AGEs刺激的HUVECs的MYPT、MLC磷酸化水平及RhoA活性。9.GLP-1显著下调AGEs刺激的HUVECs的RAGE、ROCK表达和MYPT、MLC磷酸化水平及RhoA活性,上调GLP-1R表达和PKA磷酸化水平,而GLP-1上述作用可被Exendin (9-39)、SQ22536、H89和LPA显著减弱。结论：1.2型糖尿病大鼠胸主动脉内膜通透性明显增加,AGEs刺激的内皮细胞骨架结构重排。可能由于蓄积的AGEs通过其受体(RAGE)途径激活内皮细胞Rho/ROCK信号通路从而促进MYPT磷酸化,导致MLC磷酸化水平提高,内皮细胞收缩,细胞间隙增大。2.提高活性GLP-1水平,激动GLP-1R可以缓解2型糖尿病大鼠胸主动脉内膜和AGEs刺激的内皮细胞单层高通透性,可能由于GLP-1抑制内皮细胞RAGE表达,下调内皮细胞Rho/ROCK信号通路从而抑制MYPT磷酸化和MLCK表达,导致MLC磷酸化水平降低。3.GLP-1改善糖尿病状态下血管内皮细胞骨架结构重排的机制可能为：GLP-1通过激动其受体(GLP-1R),激动cAMP/PKA信号通路,抑制RAGE表达,从而下调Rho/ROCK信号通路,最终抑制MYPT和MLC磷酸化水平,使内皮细胞向心性收缩力减小。