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目的：通过研究冬凌草离体培养过程中不同培养时期叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白、丙酮酸、POD酶活性等生理生化指标；同时通过观察不同培养时期同化淀粉粒、叶绿体、内部维管系统结构及再生植株叶片腺鳞密度的变化,从生理生化及组织结构上探讨其与冬凌草甲素的积累合成相关性,从而诠释冬凌草甲素的合成机理。
方法：采用紫外分光光度法测定了冬凌草离体培养过程中不同培养时期(外植体、愈伤组织、芽分化、再生植株)内叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白、丙酮酸的含量及POD酶活性；采用高效液相法测定了不同培养时期冬凌草甲素的含量；采用SDS-PAGE凝胶电泳、石蜡切片、透射电镜透明片等技术研究了再生植株不同培养时期蛋白组分,组织结构及叶片腺鳞密度和冬凌草甲素积累的关系。
结果：
1 冬凌草叶片脱分化形成愈伤过程中,冬凌草甲素的含量由外植体时期的 0.89% ,逐渐下降为0,之后在愈伤增殖过程中,冬凌草甲素含量依然为0,随着愈伤组织的分化,愈伤周围形成绿色芽点时,冬凌草甲素含量为0.0593%,随着芽点的不断生长、分化及再生植株的形成冬凌草甲素的含量又逐渐升高,再生植株时期含量为0.703% 。
2 叶绿素a、b及总叶绿素含量与冬凌草甲素呈正相关：当冬凌草外植体脱分化时,叶绿素a、b和总叶绿素含量迅速下降,而冬凌草甲素的含量也随之降低,当叶绿素a、b及总叶绿素含量为 0.0182 mg/g、0.0061 mg/g 、0.0271 mg/g时,冬凌草甲素含量为0,之后,随着愈伤组织的增殖及脱分化的进行,叶绿素a、b和总叶绿素含量变化较为缓慢,但在芽分化期,冬凌草甲素开始积累,此时总叶绿素含量为0.032 mg/g,叶绿素a为0.021 mg/g,叶绿素b为0.0078 mg/g,之后随着叶绿素含量增长,冬凌草甲素积累合成量也随之增加。相关性分析表明叶绿素a、b及总叶绿素与冬凌草甲素相关系数为0.783、0.705 、0.788；
可溶性蛋白质含量与冬凌草甲素变化呈显著正相关,冬凌草外植体脱分化形成愈伤过程中,可溶性蛋白含量呈下降趋势,同时冬凌草甲素含量也随之下降,当可溶性蛋白含量为1.81 mg/g时,冬凌草甲素的含量下降为0,之后,随着愈伤组织的增殖及脱分化的进行可溶性蛋白含量呈增长趋势,而冬凌草甲素含量依然为0,但在芽分化期,可溶性蛋白含量为1.87mg/g时,冬凌草甲素开始积累,之后随着可溶性蛋白含量增长,冬凌草甲素积累合成量也随之增加。相关性分析表明可溶性蛋白与冬凌草甲素相关系数为0.866；
可溶性糖含量与冬凌草甲素含量呈负相关：冬凌草外植体脱分化形成愈伤过程中,可溶性糖含量呈缓慢增长趋势,但此时冬凌草甲素含量却急剧下降,可溶性糖含量为33.48 mg/g时,冬凌草甲素含量为0,在愈伤增殖及分化过程中,可溶性糖快速积累,而冬凌草甲素含量依然为0,但在芽分化期,可溶性糖含量为28.71mg/g时,冬凌草甲素开始积累,从芽分化到再生植株形成,可溶性糖呈先增长,后降低趋势,而冬凌草甲素含量则逐渐增长。相关性分析表明可溶性糖含量与冬凌草甲素含量相关系数为-0.515；
丙酮酸含量与冬凌草甲素含量呈显著正相关：外植体脱分化形成愈伤时,丙酮酸含量迅速下降,同时冬凌草甲素含量也随之急剧下降,当丙酮酸含量降至50.9 mg/g时,冬凌草甲素的含量下降为 0,在愈伤增殖、分化过程中,丙酮酸含量呈现缓慢上升趋势,而冬凌草甲素含量依然为0,当丙酮酸含量为77.03µg /g时,冬凌草甲素开始积累,之后随着丙酮酸含量的增长,冬凌草甲素含量也一直呈上升趋势。相关性分析表明丙酮酸含量与冬凌草甲素含量相关系数为0.897。
POD酶活性与冬凌草甲素含量呈负相关：外植体脱分化形成愈伤时, POD酶活性逐渐增强,而冬凌草甲素在此过程中则呈下降趋势,当POD酶活性为120.6 U·g-1Fw,冬凌草甲素含量下降为0,在愈伤增殖及分化过程中POD酶活性仍呈增长趋势,而冬凌草甲素含量依然为0,在分化出芽点,活性为129.67 U·g-1Fw时,冬凌草甲素开始积累,之后POD酶活性降低,而冬凌草甲素积累合成量则逐渐增多。相关性分析表明POD酶活性与冬凌草甲素含量相关系数为-0.661；
SDS-PAGE凝胶电泳结果表明,在冬凌草离体培养各个时期,各蛋白表达量的差异与冬凌草甲素的含量变化趋势不相吻合,规律性不强,在芽分化期,即冬凌草甲素开始积累时,未见有特异条带出现。
3 组织形态学表明：在外植体脱分化过程中,冬凌草甲素迅速下降时,叶肉细胞与表皮细胞逐渐分离,栅栏组织的形状由长圆柱形变为不规则形状,愈伤增殖过程中细胞形态未发生变化,当冬凌草甲素开始积累时,愈伤周围有绿色芽点出现,中间愈伤褐化,内部出现导管,当愈伤边缘叶原基形成后,芽点数增多、变为扁平叶状体时时冬凌草甲素含量增加。
在外植体中同化淀粉粒和叶绿体较多,类囊体片层排列紧凑、致密,此时冬凌草甲素含量最高,随着脱分化的进行,叶绿体和同化淀粉粒数量骤减,类囊体片层变得稀疏,冬凌草甲素含量也随之降低,形成愈伤后未发现叶绿体和同化淀粉粒,此时冬凌草甲素含量为0,芽点分化形成后,叶绿体数目增多,同时伴有同化淀粉粒的出现,但类囊体片层排列稀疏,冬凌草甲素开始积累之后,随着叶绿体和同化淀粉粒的增多,冬凌草甲素含量呈增长趋势。
对冬凌草组培苗不同部位叶片中腺鳞密度的分析结果表明：位于基部的叶片腺鳞密度最低约为20个/mm2,冬凌草甲素的含量为2.58 mg/g；中部叶片腺鳞密度54个/ mm2,冬凌草甲素的含量为5.78 mg/g；而位于顶端的幼叶腺鳞密度高达114个/mm2,冬凌草甲素的含量达到21.47mg/g,两者相关性分析为显著相关,相关系数为0.99。结论：
1 叶绿素a、b和总叶绿素、丙酮酸、可溶性蛋白与冬凌草甲素的合成显著相关,其中丙酮酸的影响最大,其次为可溶性蛋白、总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b,而可溶性糖、POD酶与冬凌草甲素含量呈显著负相关,相关系数较低,对冬凌草甲素的合成有一定的影响。在冬凌草离体培养各个时期,未找到与冬凌草甲素积累相关的蛋白,在芽分化期,即冬凌草甲素开始积累时,未见有特异条带出现。
2 随着冬凌草甲素的积累,愈伤组织细胞分化形成导管,此时愈伤周围出现芽点,故维管系统及芽点的形成可能与冬凌草甲素积累合成有一定的关系。超微结构显示：冬凌草甲素积累合成与培养物内叶绿体的数量、结构(类囊体片层的疏密程度)、叶绿体内同化淀粉粒有一定关系；冬凌草叶片中的腺鳞可能为冬凌草甲素的贮存场所。