【摘 要】
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摄食活动是鱼类一切生命活动的基础。摄食是受外部(如食物供应、环境、应激等)和内部(鱼类感觉系统、激素水平、代谢物质等)因素影响的一种复杂生理行为。鱼类摄食是由中枢摄食和外周饱食系统联合调控的。“食欲调控网络”通过促食欲调节因子和抑食欲调节因子综合调控摄食行为。食欲调控机制复杂精细,鱼类中研究非常匮乏。本研究以自然界中专性植食性鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idella)和极端肉食性鱼
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摄食活动是鱼类一切生命活动的基础。摄食是受外部(如食物供应、环境、应激等)和内部(鱼类感觉系统、激素水平、代谢物质等)因素影响的一种复杂生理行为。鱼类摄食是由中枢摄食和外周饱食系统联合调控的。“食欲调控网络”通过促食欲调节因子和抑食欲调节因子综合调控摄食行为。食欲调控机制复杂精细,鱼类中研究非常匮乏。本研究以自然界中专性植食性鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idella)和极端肉食性鱼类鳜鱼(Siniperca chuatsi)为研究对象,在已有草鱼基因组、草鱼及鳜鱼转录组数据库基础上,采用分子克隆、基因表达、体外重组蛋白表达、信号转导等分子生物学技术,结合生物信息学分析,探索草鱼甜味受体对食性形成及糖类物质的差异信号响应的影响,活体注射外周关键食欲调节因子瘦素leptin和胃饥饿素ghrelin后草鱼或鳜鱼的摄食和食欲变化,及外源性糖和脂质摄入对草鱼摄食和代谢的影响。第一部分,为了探索草鱼甜味受体对食性形成及糖类物质的差异信号转导的影响,我们分析了草鱼甜味受体的基因结构和适应性进化特征及其对葡萄糖和果糖的差异响应。在草鱼中我们分析鉴定了6个甜味受体基因(命名为gcT1R2A,gcT1R2B,gcT1R2C,gcT1R2D,gcT1R2E,gcT1R2F)。进化分析表明,新形成的四个gcT1R2s(gcT1R2C,gcT1R2D,gcT1R2E,gcT1R2F)作为旁系同源基因形成于gcT1R2A之后。6个gcT1R2s均在味觉器官中表达且可以通过增强细胞内的Ca2+水平对葡萄糖或果糖进行响应,表明它们均为功能基因。特别地是,共转染6个gcT1R2s增加了草鱼对葡萄糖和果糖的感知,而共转染新形成的4个gcT1R2s只增加了草鱼对植物中特有的果糖的感知,说明这4个gcT1R2s的形成可能与草鱼由原始的肉食性向草食性的食性转变有关。这些结果表明,生物界中味觉的进化不单单只有哺乳动物中的假基因或鸟类中的缺失的进化方式,也存在鱼类中的适应性扩张的进化方式。第二部分,为了阐明外周关键食欲调节因子对摄食的调节机制,我们检测了活体注射leptin和ghrelin后草鱼或鳜鱼的摄食和食欲变化。鱼类肝脏分泌的leptin作为一个饱食信号因子参与摄食和能量平衡的调节。我们采用体外重组蛋白表达技术第一次成功的表达了鱼类leptin A和leptin B两个蛋白,通过腹腔注射探索了鳜鱼leptin A和leptin B蛋白在摄食和代谢方面的功能分化。结果显示,鳜鱼leptin B短期(2 h)内通过下丘脑食欲调控基因(NPY/Ag RP)显著抑制摄食,而leptin A未见明显的抑摄食效果。长期(7 d)腹腔注射实验结果表明,鳜鱼leptin A可能在肝脏内的脂质调控中起一定的作用,而leptin B可能通过脑中的葡萄糖感知系统对肝糖原产生负反馈调控。另外,ghrelin和肥胖抑制素obestatin是同一前体蛋白preproghrelin衍生的两种胃肠肽。本研究合成了草鱼ghrelin和obestatin两个多肽,通过腹腔注射研究ghrelin和obestatin对草鱼摄食量和食欲的影响。结果显示,只有70.8%的草鱼接受ghrelin处理后摄食量显著提高。这是第一个表明腹腔注射ghrelin并不总是导致鱼类摄食量增加的研究。在排除草鱼对ghrelin响应中个体间的异质性后,通过共注射实验发现,obestatin不能单独影响摄食量,但它可以在一定程度上抑制了草鱼ghrelin引起的高食欲。同时,我们分析了鳜鱼preproghrelin的基因结构和组织分布特征。Preproghrelin m RNA在代谢调节相关组织中广泛分布,表明了ghrelin可能在鳜鱼的能量平衡中起重要作用。禁食诱导了胃内ghrelin m RNA表达水平的增加,暗示了preproghrelin在鳜鱼中同样存在促食欲作用。第三部分,为了解析代谢产物对摄食的反馈调控机制,实验分别采用不同碳水化合物水平和不同脂肪水平的饲料喂食草鱼8周,分析外源性糖和脂质摄入对草鱼摄食和代谢的影响。一方面,通过生长性能和饲料效率评估了草鱼的饲料碳水化合物(218.1 g/kg)和脂肪(43.5 g/kg)需求,并通过血液生化成分分析和糖脂代谢关键基因表达变化解析了草鱼外源性糖和脂质摄入后的代谢适应策略;另一方面,通过分析草鱼摄食量和食欲基因及饱食信号因子leptin的表达变化,表明草鱼摄入饲料碳水化合物和脂肪饲料后增加的能量可能通过诱导瘦素leptin的表达以降低摄食。本研究从味觉受体与食性形成的关系、外周关键食欲调节因子对摄食的调节及代谢产物对摄食的反馈调控三个方面共同解析鱼类的摄食调控分子机制。研究结果将丰富鱼类摄食调控机制的研究资料,并有望为提高鱼类饲料效率并减轻对水环境污染提供理论依据。
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