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本研究以TSA为乙酰化作用因素，探讨了乙酰化对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中nNOS基因表达的调控作用，证明了TSA引起的NF-kB乙酰化对nNOS 1f启动子活性的影响是乙酰化调节nNOS表达的一种机制，并进一步研究了p300在TSA对NF-kB乙酰化水平调节中的作用。
材料与方法
一、实验材料
1、人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH2、Real-time RT-PCR及Nuclear run-off实验相关试剂3、Western印迹杂交相关试剂及NO特异性荧光染料DAF-2 DA4、基因克隆及萤光素酶报告基因检测相关试剂5、电泳泳动迁移实验(EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP)及免疫沉淀(IP)相关试剂二、实验方法1、Real-time RT-PCR方法检测TSA刺激前后总nNOS及外显子1f特异性nNOS转录本mRNA表达水平的变化；Nuclear run-off方法检测TSA对nNOS基因转录效率的影响。
2、Western印迹杂交检测TSA对nNOS蛋白表达水平的作用；DAF-2 DA荧光染色检测TSA对nNOS催化的NO合成水平的影响。
3、应用软件分析nNOS lf启动子结构；并构建系列截短的nNOS 1f启动子萤光素酶报告基因载体，应用双萤光素酶检测系统分析各段启动子的活性。
4、EMSA方法体外鉴定nNOS 1f启动子区NF-kB反应元件及TSA对NF-kB与该元件结合力的影响；ChIP实验进一步在体内条件下验证NF-kB与该位点的结合及TSA对这种结合的作用。
5、应用NF-kB p65及p50亚基特异性抗体进行免疫沉淀，并应用抗乙酰化赖氨酸单克隆抗体为一抗进行Western印迹杂交，检测TSA对p65及p50乙酰化水平的调节作用。
6、双萤光素酶报告基因检测系统鉴定NF-kB反应元件在TSA对nNOS 1f启动子活性调节中的作用。
7、应用免疫共沉淀方法，分别采用p65、p50或p300抗体进行免疫沉淀，并相应使用p300或p65、p50抗体为一抗进行Western印迹杂交，检测p300与NF-kB p65、p50亚基的相互作用及TSA对这种作用的影响；应用p300特异性抗体进行ChIP实验，检测p300与染色质NF-kB反应元件区域的结合及TSA对其的作用；采用Western印迹杂交检测TSA对p300表达水平的影响。 8、细胞转染野生型或HAT结构域缺失的突变型p300表达载体后，以p300抗体进行免疫沉，抗乙酰化赖氨酸抗体为一抗进行Western印迹杂交，检测p300对NF-kB的乙酰化作用及TSA对这种作用的影响。
结果
1、Real-time RT-PCR结果证明外显子1f特异性转录本为SK-N-SH细胞中nNOS基因最主要的转录本，同时TSA以时间及浓度依赖方式上调总nNOS及外显子1fnNOS mRNA表达水平；nuclear run－off实验证明TSA使nNOS转录效率提高。
2、Western印迹杂交及DAF-2 DA荧光检测显示TSA使SK-N-SH细胞中nNOS蛋白及nNOS催化的NO合成水平显著增加。
3、软件分析发现nNOS 1f启动子内存在一些潜在的受乙酰化修饰的转录因子结合位点；萤光素酶报告基因检测在启动子内发现两个正调控区和两个负调控区。
4、EMSA实验在体外条件下证明了nNOS 1f启动子-893～884区为NF-kB反应元件，并且TSA使NF-kB p65及p50亚基与该位点结合增强；ChIP实验进一步在体内条件下获得了相同的结果。
5、免疫沉淀结合Western印迹杂交在基础状态下观察到了NF-KB p65及p50亚基的乙酰化，并且TSA可上调二者乙酰化水平。
6、应用萤光素酶报告基因系统证明了本实验所鉴定的NF-kB反应元件是nNOS 1f启动子中一个强大的正调控元件，同时它在TSA引起的nNOS 1f启动子的转录激活中发挥重要作用。
7、免疫共沉淀结果显示细胞核中p300与NF-kB p65及p50亚基之间存在相互作用，TSA可加强二者间的作用；ChIP结果提示p300参与结合nNOS 1f启动子NF-kB反应元件，TSA可募集p300至该区域；Western印迹杂交显示TSA能够上调p300蛋白表达水平。
8、免疫沉淀结合Western印迹杂交显示p300能够直接乙酰化NF-kB p65及p50亚基，并且TSA使p300的作用增强。
结论
1、nNOS 1f启动子-893～884区为NF-kB反应元件。
2、TSA通过增强p300与NF-kB p65及p50亚基在nNOS 1f启动子NF-kB反应元件区的相互作用，而加强p300对p65和p50的乙酰化，进而增强NF-kB的DNA亲和力以引起nNOS 1f启动子转录激活，这是TSA上调nNOS mRNA和蛋白表达水平及nNOS催化的NO合成的机制之一。
3、nNOS外显子1f特异性转录本为SK-N-SH细胞中nNOS基因最主要的转录本。