阿维A调节外周血树突状细胞相关免疫功能的实验研究

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目的:树突状细胞(dendritic cells, DCs)是体内功能最强的、专职的抗原呈递细胞(antigen presenting cell, APC),是唯一能够激活“初始型”免疫反应的细胞,可显著地刺激初始T细胞的增殖和活化,在免疫应答的启动和免疫调控方面发挥着重要作用,是最强大的次级免疫反应的诱导物。维甲酸类(retinoc acid,RA)是维生素A的天然及人工合成的衍生物。包含多种同分异构体:13-顺式维甲酸(13-cis-retinoic acid,13-cRA),全反式维甲酸(all-trans retinoic,ATRA),9-顺式维甲酸(9-cis-retinoicacid,9-cRA)等。它能影响细胞的增殖和分化,调控多种细胞的形态变化并参与细胞凋亡代谢过程,在临床实践中多用来预防及治疗多种皮肤病。近年来科学研究发现它对人体免疫系统具有很强的调节作用。阿维A为第二代维甲酸类药物,化学名称是全反式-9-(4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯基)-3,7-二甲基-2,4,6,8-壬四烯酸,具有调节表皮细胞分化和增殖的作用,临床上用于治疗多种皮肤病,如银屑病、角化性皮肤病等。本实验研究阿维A作用于正常人外周血DCs通过观察DCs的形态,流式细胞仪技术检测DCs表面标记CD83、CD86的表达,应用酶联免疫吸附实验检测细胞因子IL-12的量及用同种异体混合淋巴细胞反应来评价DCs刺激T淋巴细胞增殖的能力,来探讨阿维A调节人免疫系统的机制,进而为临床治疗自身免疫性疾病提供实验基础。方法:1细胞培养采集并分离10例健康人外周血单个核细胞在含15%胎牛血清的RPMI-1640培养基(含青霉素100U/ml,含链霉素100U/ml,PH7.2)和rhIL-4和rhGM-CSF的作用下,置于5%CO2和37℃培养箱中培养。2运用流式细胞仪技术(Flow cytometry,FCM)检测与细胞免疫成熟和激活相关的表面标记CD83的表达情况将实验分为3组,分别为阴性对照组和两个加药组,加药组分别为阿维A浓度为1nmol/L一组和阿维A浓度为10nmol/L一组。阴性对照组不加阿维A培养8天,加药组在培养第7天按药物的不同浓度加入药物干预12h,收集细胞,应用FCM检测各组细胞表面标记CD83的表达情况。3运用FCM检测与细胞免疫成熟和激活相关的表面标记CD86的表达情况将实验分为3组,分别为阴性对照组和两个加药组,加药组分别为阿维A浓度为1nmol/L一组和阿维A浓度为10nmol/L一组。阴性对照组不加阿维A培养8天,加药组在培养第7天按药物的不同浓度加入药物干预12h,收集细胞,应用FCM检测各组细胞表面标记CD86的表达情况。4倒置相差显微镜观察经过不同浓度药物处理前后DCs的形态变化。5用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测不同浓度的阿维A对DCs干预12h后细胞因子的分泌的影响。将实验分为3组,分别为阴性对照组和两个加药组,加药组分别为阿维A浓度为1nmol/L一组和阿维A浓度为10nmol/L一组。阴性对照组不加阿维A培养8天,加药组在培养第7天按药物的不同浓度加入药物干预12h,收集细胞的培养上清液,应用ELISA法检测各组细胞培养上清液中IL-12的水平。6用同种异体混合淋巴细胞反应来评价DCs刺激T淋巴细胞增殖的能力用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组DCs对同种异体混合淋巴细胞增殖的程度。7运用统计软件SPSS13.0对数据进行统计分析。结果:1运用FCM检测与细胞免疫成熟和激活相关的表面标记CD83的表达情况。经不同浓度药物作用后,与阴性对照组相比,表面标记CD83的表达明显增高,阴性对照组、不同浓度阿维A干预12h后,CD83的表达量分别为42.55±10.58、52.93±12.87、59.80±12.47,分别进一步进行两两比较也都有显著性差异(p<0.05)。2运用FCM检测与细胞免疫成熟和激活相关的表面标记CD86的表达情况。经不同浓度药物作用后,与阴性对照组相比,表面标记CD86的表达明显增高,阴性对照组、不同浓度阿维A干预12h后,CD86的表达量分别为57.49±10.63、67.24±10.55、72.89±10.18,分别进一步进行两两比较也都有显著性差异(p<0.05)。3阿维A对DCs形态的影响阴性对照组:DCs形态不规则,少部分细胞贴壁生长,大部分细胞呈悬浮状态生长;经阿维A处理细胞12h后,通过倒置显微镜观察,贴壁生长的细胞减少,悬浮生长的细胞增多,并随浓度增加悬浮生长的细胞增多的现象更加明显。4用ELISA法检测阿维A对DCs分泌的IL-12水平的影响。经不同浓度药物作用后,与阴性对照组相比,分泌的IL-12的量逐渐增多。阴性对照组、不同浓度阿维A干预12h后IL-12的分泌量分别为50.047±22.660、59.762±23.299、74.657±26.252,分别进一步进行两两比较差异也都有显著性差异(p<0.05)。5用MTT比色法检测阿维A处理前后各组细胞对同种异体淋巴细胞的增殖的变化。经不同浓度药物作用后的DCs刺激的混合淋巴细胞的增殖率(10.96±1.41,11.88±1.38)与阴性对照组(5.29±0.69)相比明显上调(p<0.05),但两加药组之间比较无统计学差异。结论:1.阿维A对DCs细胞表面标志CD83、CD86的表达有增强作用。2阿维A可以增强DCs对同种异体混合淋巴细胞增殖的刺激作用。3.阿维A可以促进DCs细胞因子IL-12的分泌。4阿维A可增强DCs的抗原提呈能力并可促进DCs向成熟方向分化。
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