由于双壳贝类滤食的习性,在生长过程中极易富集环境中的有害因子,这不仅会损害贝类正常的生长生理和免疫活力,人们食用了被污染的贝类后也极易引发食物中毒。近年来,水产品安全己成为制约当前水产养殖业持续发展的关键问题之一。为进一步研究扇贝产品质量与养殖环境的相关关系,探讨细菌在贝类体内消长的特征和机理,本文在研究了獐子岛海域养殖环境、虾夷扇贝体内的污染物时空分布和综合评价的基础上,选择具有高污染风险的海洋细菌作为对象,研究了不同细菌在扇贝体内的累积及组织分布差异,不同饵料及投喂量对细菌净化的影响,并探讨了细菌的感染对虾夷扇贝消化酶和免疫酶活性的影响。研究结果对水产动物益生菌的开发具有一定指导作用,并为虾夷扇贝的健康、可持续养殖提供科学依据。主要研究结果如下:1.于2008年4、6、8、9、10和11月,在獐子岛虾夷扇贝养殖区共进行6个航次的调查,对海水、沉积物和不同养殖方式的贝类产品中重金属(Cu、Pb、Cd、Zn)、微生物(细菌总数和大肠菌群)含量进行了监测,同时监测了贝类毒素(麻痹性贝毒PSP和腹泻性贝毒DSP)含量。结果显示,獐子岛海域活性磷酸盐的含量范围是1.20-28.20μg/L,均符合《海水水质标准》二类标准值。无机氮(DIN)的含量范围是33.65-663.44μg/L,6月份所有测站和11月的近岸2个测站均超过二类标准值。海水和沉积物中重金属含量均符合《海水水质标准》和《海洋沉积物质量》的一类标准值。与大肠菌群相比,海水中的细菌总数与环境因子的相关性更强,与海水的溶解氧呈强负相关(R = -0.788),与pH(R = -0.584)和水温(R = -0.572)呈中等程度正相关。溶解氧是所调查项目中对海水细菌的主要限制因子,pH和水温对其也有一定影响。贝类监测结果显示:(1)虾夷扇贝体内4种重金属和2种贝毒含量均符合《海洋生物质量》的一类标准值,8月份Pb(0.11 mg/kg)和Cd(0.20 mg/kg)平均含量最高,Zn含量范围是12.73-19.81 mg/kg,11月平均含量最高。研究结果表明,虾夷扇贝累积重金属的能力与养殖方式、环境条件和贝类生理状态等具一定的相关关系。筏式1龄贝最容易累积Pb和Cu,而底播贝更容易累积Cd。贝类体内与沉积物中的铜和锌含量分别具有强正相关,而扇贝体内的铅与海水中的铅浓度呈现中等程度正相关(R = 0.436),与镉的相关性较差。(2)近岸的底播贝6月份PSP含量出现最高值(73.20μg/100g),11月份均未检测到PSP。PSP的平均含量与海水中活性磷酸盐呈强负相关(R = -0.655),活性磷酸盐可能是产PSP赤潮藻的主要限制因子。PSP在虾夷扇贝中肠腺中含量最高,约为全贝平均含量的4.92-8.17倍,鳃和外套膜次之,闭壳肌中最低,约为全贝平均含量的60%左右。(3)调查期间,贝类体内细菌总数的月平均值呈逐渐增加增加,至8月达到最大;9月降低,10月又有所回升,数量达3150 cfu/g,11月再次降低至调查期间最低值;大肠杆菌,在6月份的1号站贝类体内数量最高,每月均可检测到大肠菌群。筏式养殖的和龄期小的扇贝易于累积环境中的细菌。贝类体内的大肠菌群与海水中的大肠菌群具有显著的极强正相关(R = 0.947,P < 0.01),与贝类体内的细菌总数也有强正相关(R = 0.693),与海水中的pH呈强负相关,但与海水中的细菌总数关系不大。扇贝体内的大肠菌群(y, cfu/g)与海水中的大肠菌群(x1, cfu/mL)和扇贝体内细菌总数(x2,×103 cfu/g)的函数关系分别为y = 1.4689x1 + 2.6488 (R2 = 0.9422),y = 8.3402x2 + 2.5719 (R2 = 0.7786);扇贝体内的细菌总数(y,×103 cfu/g)与海水中大肠菌群(x, cfu/mL)的函数关系为y = 4.3612x2 - 75.457x + 326.62 (R2 = 0.9017)。獐子岛养殖区生态环境质量在4、11月为“优”,其他月份均维持在“良”的水平。獐子岛表层沉积物中重金属的潜在生态风险均为极低水平。虾夷扇贝全年质量总体为“良”,其制约因素主要为6-10月的PSP和大肠菌群。2.采用接触染毒法,研究了大肠杆菌和粪肠球菌在虾夷扇贝体内累积消长规律,结果表明,1-3d细菌累积量达到峰值;从生物富集系数(BCF)和累积量的增长率(RA)值可以看出,粪肠球菌处理组均高于大肠杆菌处理组,说明扇贝更容易从环境中累积粪肠球菌。从两种细菌在扇贝体内各组织中的分布看,消化道内含量最大,大肠杆菌和粪肠球菌在消化道中的含量分别比全部软组织含量高5.7倍和12.9倍;血淋巴中的含量最小,分别是全部软组织含量的6.0%和13.9%;血淋巴中粪肠球菌的含量高于大肠杆菌85倍。净化实验表明,净化24h时,投喂0.03%和0.05%螺旋藻组净化率高于盐藻投喂组,均在90%以上。因此,在净化初期,螺旋藻能提高净化率;在实验条件下,高浓度盐藻不利于扇贝体内细菌的净化。3.研究了扇贝体内细菌含量对其消化生理的影响。结果显示,暴露在高于3 log10CFU/mL大肠杆菌和粪肠球菌的环境中,扇贝消化酶活性明显受到了抑制。大肠杆菌对扇贝消化酶活性的抑制作用比粪肠球菌更为明显。采用接触染毒和注射染毒两种感染方式发现,接触染毒大肠杆菌组胰蛋白酶活性明显低于粪肠球菌,而注射染毒组之间无差异。4.采用二次接触染毒法、大肠杆菌和粪肠球菌全菌体抗原、基因组DNA和活菌注射法和接触染毒法,研究了扇贝体内细菌含量与扇贝免疫活性的关系。(1)二次染毒实验结果表明,实验1 d后,再次暴露大肠杆菌处理组扇贝血清中的SOD和ACP活性均明显高于一次暴露处理的扇贝(P < 0.05),但这种作用仅能维持在2周以内。这说明扇贝对细菌感染有一定的记忆能力,在再次感染时表现一定的“获得性免疫”的特征。(2)注射实验4 h后,各处理组血清中的SOD酶活性均高于空白组(Ct),但差异不显著(P > 0.05)。注射两种细菌细胞抗原组分后,扇贝血清中的SOD酶活性均呈现活菌>全菌体抗原>细菌基因组DNA注射组;而全菌体抗原和细菌基因组DNA注射组中,大肠杆菌处理组的SOD酶活性均低于粪肠球菌。72 h后,粪肠球菌全菌体抗原注射组的酶活性最高,明显高于大肠杆菌全菌体抗原处理组(P < 0.05),其他组之间没有显著差异。(3)细菌的累积对3龄扇贝免疫因子的影响实验结果表明,扇贝在长期暴露于细菌的环境中,血清中的免疫酶活性明显高于血细胞。粪肠球菌处理的扇贝ACP活性比大肠杆菌组低。