微流控芯片技术在生化样品分析中的应用研究

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微流控芯片实验室又称微流控芯片或芯片实验室,指的是在一块几平方厘米的芯片上构建的化学或生物实验室。它把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块很小的芯片上,由微通道形成网络,以可控流体贯穿整个系统,用以实现常规化学或生物实验室的各种功能。作为一种分析平台,微流控芯片实验室主要以芯片毛细管电泳的形式开始研究,因其尺寸微小,又将多种操作单元集成在一起,具有响应速度快、样品消耗低、高通量、便于携带等优势。微流控芯片实验室应用广泛,已经涉及到了环境监测、食品检查、药物筛选,疾病治疗等诸多领域,近些年来在分析分离领域越来越受到科研工作者们的重视和青睐。但是,芯片尺寸微小造成进样量小,检测光程较短,导致检测灵敏度达不到生物体系中痕量组分的检测要求。为了提高仪器的检测灵敏度,除了改进和完善各类检测器外,还可以研究将各种富集技术与微流控芯片联用,进一步提高检测灵敏度。本文采用微流控芯片电泳(MCE),联合激光诱导荧光检测器(LIF),结合在线富集法,探讨了微流控芯片电泳在生化分析中的一些应用,主要内容如下:第一章简要介绍微流控芯片电泳的发展历史、基本特征、进样方式、检测技术、在线富集技术和应用领域,并介绍了本文的研究内容和意义。第二章以异硫氰酸荧光素(FITC)为柱前衍生试剂,基于场放大堆积富集法(FASI)建立了奶酪中两种β-酪啡肽β-CM-5和β-CM-7的MCE-LIF检测法。两分钟内成功分离检测了β-CM-5和β-CM-7。研究结果表明,β-CM-5和β-CM-7的检出限分别为8.2和3.6 nM,线性范围分别是0.05-2μM和0.02-1μM,加标回收率在86.9%-107.5%的范围内。第三章采用MCE-LIF结合场放大堆积富集法(FASI)建立了一种快速、超灵敏检测河水中大肠杆菌的方法。该法通过间接检测大肠杆菌代谢过程中产生的特异性酶β-半乳糖苷酶(β-gal)活性,确定大肠杆菌浓度。β-gal可以水解底物中的4-氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PAPG),产生4-氨基酚(PAP),经异硫氰酸荧光素(FITC)衍生后进行检测,PAP的浓度与大肠杆菌的浓度间存在良好的线性关系。最佳实验条件下,大肠杆菌浓度的线性范围是20-500 CFU m L-1,检测限低至10 CFU mL-1。采用本方法成功检测到河水中大肠杆菌的浓度是23 CFU mL-1。第四章采用MCE-LIF法建立了一种快速检测DNA甲基转移酶Dam浓度的方法。此法基于双链DNA经甲基转移酶甲基化处理后无法被甲基化敏感的限制性内切酶切断的原理,采用MCE法分离检测完整的双链DNA与被切断的双链DNA,根据完整双链DNA的浓度确定Dam甲基转移酶的浓度。此方法无需复杂的前处理过程,DNA荧光信号与Dam甲基转移酶的浓度在0.5-20.0 U/mL的范围内存在良好的线性关系,方法的检测限低至0.12 U/mL,在DNA甲基转移酶抑制剂的筛选及抗癌药物研发中有潜在的应用前景。
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