目的：乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，严重危害着女性的生命和健康。近年来我国乳腺癌的发病率持续上升,且发病年龄呈年轻化。内分泌治疗以其副作用小、效应持久，成为乳腺癌最重要的治疗手段之一。他莫昔芬是一种选择性雌激素受体调变剂，用于绝经前雌激素受体阳性的乳腺癌患者的内分泌治疗。目前临床上约40%雌激素受体（estrogen receptor,ER）阳性的乳腺癌患者对抗雌激素治疗产生耐药，而具体机制尚不明确。PAX2基因定位于人类10号染色体长臂的2区4带（10q24），其编码成对基因盒2，其最早从果蝇中发现，被认为是抑癌基因WTI的转录抑制因子。前期的回顾性研究表明，配对盒基因（PAX2）和AIB1与HER2的表达水平相关，而抗雌激素治疗的代表药物他莫昔芬耐药的乳腺肿瘤特征为HER2高表达；目前有关PAX2和AIB1在乳腺癌内分泌治疗耐药机制中的研究鲜有报道。鉴于此，本文对PAX2和AIB1在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中的表达及其调控HER2表达的相关机制进行了较为系统的实验研究，为他莫昔芬耐药机制的相关研究提供了分子生物学基础。方法：1细胞培养与处理本实验采用人乳腺癌MCF-7和MCF7/TAMR2种细胞株。人乳腺癌MCF-7细胞常规培养在含有10%胎牛血清、100U/L青链霉素的RPMI-1640培养基中，置于含5%CO2的37摄氏度恒温恒湿培养箱中培养。采用4-OHTAM长期暴露法诱导出人乳腺癌MCF7/TAMR亚型，其培养条件同MCF-7细胞。分别给予溶剂对照（0.01%的无水乙醇）及1μM的TAM处理24h。9nM针对HER2的抑制剂Lapatinib预处理0.5h。2siRNA和质粒转染分别用100pmol阴性对照NC siRNA和PAX2siRNA转染MCF-7细胞24h后，再给予1μMTAM处理24h，同法将AIB1siRNA转染MCF7/TAMR进行实验研究。分别用1μg表达AIB1的质粒和作为阴性对照的空载体质粒转染MCF-7细胞中，再给予1μMTAM处理24h，同法将PAX2质粒转染MCF7/TAMR细胞并处理。3蛋白免疫印迹（Western blot）提取细胞总蛋白，用蛋白免疫印迹方法检测各蛋白的表达情况，再通过Odyssey成像系统进行显色并分析数据。4实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR）提取细胞的总RNA反转录为cDNA，用实时定量PCR检测人乳腺癌MCF-7和MCF7/TAMR细胞中AIB1、PAX2、HER2mRNA表达情况，并用GeneAmp PCR系统进行分析。5MTT比色法测定细胞增殖siRNA或质粒转染再给予TAM处理后，分别收集各组细胞，用MTT处理后利用多功能酶标仪测定各个孔在570nm处的OD值，来反应细胞增殖情况。6统计学分析采用SPSS（13.0）软件进行数据分析，两均数比较的t检验分析和单因素方差分析（analysis of variance,ANOVA），数据用x±SD表示，每组实验不少于3次独立样本的重复，检验以P<0.05为差异有显著性意义。结果：1PAX2、AIB1、HER2在人ER阳性乳腺癌细胞中的表达情况Western bolt检测结果表明，PAX2、AIB1、HER2蛋白在雌激素受体阳性的乳腺癌MCF-7及MCF7/TAMR细胞中均表达。在MCF-7细胞的两种亚型中，MCF7/TAMR细胞中PAX2蛋白的相对表达量低于野生型MCF-7细胞，而HER2蛋白表达较高，二者AIB1表达差异无统计学意义。2TAM处理对乳腺癌细胞增殖及AIB1、PAX2及HER2蛋白表达的影响2.1TAM处理对乳腺癌细胞增殖的影响MTT分析结果：随着TAM浓度的升高，MCF-7细胞增殖逐渐降低；而低浓度TAM对MCF7/TAMR细胞呈现出刺激增值的作用，高浓度TAM呈现出抑制作用。2.21μM TAM处理MCF-7和MCF7/TAMR细胞对AIB1、PAX2及HER2蛋白表达情况的影响TAM处理前后，在MCF-7细胞中，TAM刺激后AIB1表达显著升高，PAX2、 HER2表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而在MCF7/TAMR细胞中，TAM刺激使得HER2、PAX2、AIB1蛋白表达均无显著性差异（P＞0.05）。3PAX2在乳腺癌中的生物学功能研究3.1利用siRNA干扰技术，体外观察PAX2在乳腺癌中的作用3.1.1沉默PAX2对TAM刺激下MCF-7细胞HER2、AIB1表达的影响Real-time PCR结果显示，在MCF-7细胞中，PAX2siRNA+TAM处理组细胞中HER2mRNA的表达水平与PAX2siRNA+Vehicle处理组无显著差异(P＞0.05)。Western blot结果显示，与PAX2siRNA+Vehicle组相比，PAX2siRNA+TAM组中HER2在蛋白水平上的相对表达量无显著差异(P＞0.05)。结果提示，PAX2基因的沉默消除了TAM引起的MCF-7细胞HER2转录抑制和HER2蛋白表达降低。在MCF-7细胞中，沉默PAX2之后，Western blot检测结果显示，加入TAM处理后， PAX2siRNA+TAM组中AIB1蛋白与PAX2siRNA+Vehicle组相比表达水平降低(P＜0.05)。3.1.3沉默PAX2基因对乳腺癌细胞TAM治疗敏感性的影响MTT检测结果表明，MCF-7细胞转染PAX2siRNA，再给予TAM处理后24小时后，可见细胞增殖活性较PAX2+Vehicle组差异无统计学意义(P＞0.05)。使用针对HER2的特异性阻断剂拉帕替尼预处理后，MCF-7细胞沉默PAX2给予TAM处理后较未给予拉帕替尼处理的细胞细胞增殖明显受到抑制。3.2利用质粒转染技术过表达PAX2，体外观察其在乳腺癌中的作用3.2.1过表达PAX2对TAM刺激下MCF7/TAMR细胞HER2、AIB1表达的影响Real time-PCR结果显示：PAX2质粒+TAM处理组细胞中HER2mRNA的表达水平与PAX2质粒+Vehicle处理组相比明显减低。Westernblot检测结果显示，与空载质粒+TAM组相比，PAX2质粒+TAM组中HER2在蛋白水平上的相对表达量明显减低。在MCF7/TAMR细胞系中，转染进外源性PAX2之后，Western blot检测结果显示，不同于MCF7/TAMR细胞，加入TAM处理后，PAX2质粒+TAM组较PAX2+Vehicle组AIB1蛋白的相对表达量减少。3.2.2过表达PAX2基因对乳腺癌细胞TAM治疗敏感性的影响MTT检测结果表明，MCF7/TAMR细胞给予TAM处理前后细胞生长加快；MCF7/TAMR细胞给予PAX2质粒+TAM处理后24小时，可见细胞增殖活性低于PAX2+Vehicle细胞（P<0.05）。4AIB1在乳腺癌中的生物学功能研究4.1利用质粒转染技术过表达AIB1，体外观察其在乳腺癌中的作用4.1.1过表达AIB1对TAM刺激下MCF-7细胞HER2、PAX2表达的影响Real time-PCR结果显示：AIB1质粒+TAM处理组细胞中HER2mRNA的表达水平与AIB1质粒+Vehicle组相比明显增高。Western blot检测结果显示，AIB1质粒+TAM处理组细胞中HER2蛋白的表达水平与AIB1质粒+Vehicle组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。在MCF-7细胞系中，转染进外源性AIB1之后，Western blot检测结果显示，AIB1质粒+TAM处理组细胞中PAX2蛋白与Vector+TAM处理组相比表达增加。4.1.2过表达AIB1基因对乳腺癌细胞TAM治疗敏感性的影响MTT检测结果表明，MCF-7细胞给予AIB1质粒+TAM组处理后24小时，可见细胞增殖活性较AIB1质粒+Vehicle组差异无统计学意义。而针对HER2的抑制剂拉帕替尼预处理后，细胞增殖活性受到抑制。4.2利用siRNA干扰技术，体外观察AIB1在乳腺癌中的作用4.2.1沉默AIB1对TAM刺激下MCF7/TAMR细胞HER2、PAX2表达的影响Real-time PCR结果显示，在MCF7/TAMR细胞中TAM对HER2表达无明显影响，而MCF7/TAMR细胞中沉默AIB1恢复了TAM下调HER2转录的作用。Western blot结果显示，与AIB1siRNA+Vehicle组相比，AIB1siRNA+TAM组中HER2在蛋白水平上的相对表达量降低。在MCF7/TAMR细胞中，沉默AIB1之后，Western blot检测结果显示，与AIB1siRNA+Vehicle组相比，AIB1siRNA+TAM组中PAX2蛋白表达水平升高。4.2.3沉默AIB1基因对乳腺癌细胞TAM治疗敏感性的影响MTT检测结果表明，MCF7/TAMR细胞转染AIB1siRNA后，细胞增殖活性降低；通过siRNA抑制AIB1表达后，恢复了MCF7/TAMR对TAM的敏感性。结论：1PAX2、AIB1在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中均表达，在HER2高表达的TAM耐药株中PAX2表达较TAM敏感的细胞株低，而二者AIB1表达水平相当。2PAX2过表达增加乳腺癌细胞对TAM的敏感性，AIB1过表达则减低了其敏感性；预示了AIB1和PAX2可能作为乳腺癌内分泌治疗耐药的预测指标。3PAX2是TAM治疗过程中HER2的转录抑制因子，针对PAX2的特异激活剂有望成解救乳腺癌内分泌治疗耐药的新靶点。4AIB1与PAX2相互调节，并可能通过竞争性结合HER2上游的调节因子，调控HER2的转录，从而影响雌激素受体阳性乳腺癌TAM治疗的敏感性。