目的：　　本研究拟观察慢病毒介导的内源性PAX6基因抑制对人类视网膜母细胞瘤细胞增殖和周期的影响，从机制上探索PAX6基因治疗与细胞周期特异化疗药物联合治疗视网膜母细胞瘤的可能性，以期提高临床上视网膜母细胞瘤对化疗药物治疗的敏感性。并且对细胞周期特异化疗药物的半数抑制浓度和PAX6基因上下游因子进行初步探索，为今后视网膜母细胞瘤新的联合用药方案及治疗机制研究奠定理论基础。　　材料与方法：　　本实验首先构建慢病毒PAX6干扰载体，筛选有效的PAX6基因靶点，分别使用等量的空白慢病毒载体和作用于PAX6基因的PAX6-RNAi-GFP慢病毒载体感染人类视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb50和Y79细胞，即为阴性对照慢病毒载体组和慢病毒PAX6抑制组。应用流式细胞技术筛选稳定细胞株，然后在基因水平和蛋白水平验证PAX6抑制效率。接着本实验检测慢病毒感染前后SO-Rb50和Y79细胞细胞周期和凋亡的改变;通过实时定量PCR技术检测cdc25A，CDK2,PCNA，CDK1，p21mRNA表达丰度的变化;通过Western blot技术检测bcl-2，BAX,PCNA,CDK1蛋白表达量的变化。据此评估细胞内源性PAX6基因表达丰度的变化对视网膜母细胞瘤细胞细胞生物学功能的影响，并初步研究其相关分子作用机制。另外用CCK-8法体外测定肿瘤细胞对长春新碱(Vincristine)、依托泊苷(Etoposide)等化疗药物作用敏感性的影响。最后通过实时定量PCR技术初步探索嗅素结构域基因家（OLFM家族）在视网膜母细胞瘤细胞系中的表达情况。　　结果：　　一、PAX6基因靶点的筛选　　本实验为了选取有效的作用于PAX6基因的靶点，针对PAX6基因设计并构建了七个靶点的慢病毒载体(KD1-KD7)，慢病毒载体感染目的细胞(SO-Rb50细胞)后，通过倒置荧光显微镜并使用实时定量PCR内源筛选出效率最高的靶点为KD4，抑制效率可达45％。但是为了达到更好的PAX6基因抑制效果，本实验采取了作用于两个靶点的慢病毒载体共感染SO-Rb50和Y79细胞，最后实验筛选得到KD4+KD1靶点共感染视网膜母细胞瘤细胞PAX6基因抑制率最高，最高可达64％。　　二、慢病毒载体感染效率　　本实验为了研究内源性PAX6基因的功能，我们用携带有GFP标记和PAX6干扰序列的慢病毒载体感染两株视网膜母细胞瘤细胞系（SO-Rb50和Y79细胞）细胞。感染复数采用MOI=80。感染4天后，应用荧光倒置显微镜观察比较各组细胞明视野和荧光视野内表达绿色荧光蛋白（GFP）的细胞百分率，估算细胞转染效率。接着应用流式细胞技术进行细胞筛选，获得稳定细胞株，进行后续实验。　　三、体外培养的视网膜母细胞瘤细胞内源性PAX6基因的抑制效率　　慢病毒感染细胞后，本实验在基因水平和蛋白水平验证内源性PAX6mRNA的抑制效率。研究表明PAX6基因抑制后两株视网膜母细胞瘤细胞（Y79和SO-Rb50细胞）内源性PAX6mRNA相对表达丰度(分别为0.52±0.09和0.55±0.10)较阴性对照慢病毒载体组(分别为1.04±0.11和1.23±0.19)和未转染组（分别为1.00±0.00和1.00±0.00）明显下降(ANOVA，SO-Rb50组:F=37.433，P＜0.001;Y79组:F＝24.188，P＜0.002)。同时，两株视网膜母细胞瘤细胞系抑制组PAX6蛋白表达水平显著下降（P＜0.05）。　　四、体外培养的视网膜母细胞瘤细胞PAX6基因抑制后细胞凋亡的变化　　本实验在慢病毒载体感染两株视网膜母细胞瘤细胞获得稳定细胞系后，运用PE标记的AnnexinV凋亡检测试剂盒来检测细胞的凋亡变化，流式细胞技术检测结果提示PAX6基因抑制后实验组比慢病毒阴性对照组和未转染组细胞凋亡率明显下降（SO-Rb50组:t=4.036，P=0.056;Y79组:t=7.948，P＝0.015），两株细胞慢病毒阴性对照组和未转染组相比，统计学上未见明显变化(SO-Rb50组:t=0.103,P＝0.927;Y79组:t=-0.017,P=0.988)。　　五、体外培养的视网膜母细胞瘤细胞PAX6基因抑制后细胞周期各时相的变化　　本实验在慢病毒载体感染两株视网膜母细胞瘤细胞获得稳定细胞系后，运用流式细胞术检测细胞周期各时相的变化。结果提示SO-Rb50细胞PAX6抑制组S期细胞比率（40.00±1.10％）较阴性对照慢病毒载体组（34.69±3.17％）明显升高（t=-4.44;P=0.047）;SO-Rb50细胞PAX6抑制组期G0/G1期细胞比率较阴性对照慢病毒载体组未见明显统计学差异（P＞0.05）;SO-Rb50细胞PAX6抑制组期G2/M期细胞比率较阴性对照慢病毒载体组未见明显统计学差异（P＞0.05）。Y79细胞PAX6抑制组G2/M期细胞比率（16.92±1.89％）较阴性对照慢病毒载体组（10.78±2.23％）明显升高（t=-8.31，P＝0.02）;Y79细胞PAX6抑制组期G0/G1朔细胞比率较阴性对照慢病毒载体组未见明显统计学差异（P＞0.05）;Y79细胞PAX6抑制组期S期细胞比率较阴性对照慢病毒载体组未见明显统计学差异（P＞0.05）。　　六、体外培养的视网膜母细胞瘤细胞PAX6基因抑制后细胞周期相关因子的实时定量PCR检测　　本实验慢病毒载体感染两株视网膜母细胞瘤细胞导致PAX6基因抑制后，应用实时定量技术（SYBR相对定量法）检测细胞周期相关因子的变化。结果提示在SO-Rb50细胞组cdc25A，CDK2，PCNA和CDK1因子mRNA水平在实验组（分别为cdc25A:2.93±0.16;CDK2:1.75±0.11;PCNA:3.16±0.35;CDK1:2.11±0.21）比阴性对照组（分别为cdc25A:1.00±0.00;CDK2:1.00±0.00;PCNA:1.00±0.00;CDK1:1.00±0.00）明显升高(分别为cdc25A:t＝-21.47;P=0.002;CDK2:t=-11.56;P=0.007;PCNA:t=-10.86;P=0.000;CDK1:t=-9.22;P=0.012)。p21因子mRNA水平在实验组（0.35±0.03）比阴性对照组（1.00±0.00）明显降低(t=37.25;P=0.000)。在Y79细胞组cdc25A，CDK2和p21因子mRNA水平在实验组（分别为cdc25A:0.36±0.07;CDK2:0.28±0.03;p21:0.37±0.08）比阴性对照组（分别为cdc25A:1.00±0.00;CDK2:1.00±0.00;p21:1.00±0.00）明显降低(分别为cdc25A:t=15.91;P=0.004;CDK2:t=46.77,.P=0.000;p21:t=14.37;P=0.005)。PCNA和CDK1因子mRNA水平在实验组(PCNA:2.79±0.16;CDK1:1.56±0.31)比阴性对照组（PCNA:1.00±0.00;CDK1:1.00±0.00）明显升高(PCNA:t＝-19.47;P=0.003;CDK1:t=-3.15;P=0.034)。　　七、体外培养的视网膜母细胞瘤细胞PAX6基因抑制后细胞周期和凋亡相关因子的westernblot检测　　本实验慢病毒载体感染两株视网膜母细胞瘤细胞导致PAX6基因抑制后，应用westernblot技术检测细胞凋亡（bcl-2和BAX）和周期（CDK1和PCNA）相关蛋白因子的变化。在两株视网膜母细胞瘤细胞（SO-Rb50和Y79细胞）中，bcl-2，CDK1和PCNA因子蛋白水平在实验组比阴性对照组明显升高(SO-Rb50组:bcl-2.:t=-5.90,P=0.028;CDK1:t=-5.27,P=0.034;PCNA:t=-4.32,P=0.05;Y79组:bcl-2:t=-4.86,P=0.04;CDK1:t=-7.60,P=0.017;PCNA:t=-11.49,P=0.007)。BAX因子蛋白水平在实验组比阴性对照组明显降低（SO-Rb50组:t=4.51，P=0.046;Y79组:t=67.96，P=0.000）。内参β-actin蛋白水平在各组之间未见明显变化(P＞0.05)。　　八、长春新碱(Vincristine)、依托泊苷(Etoposide)等化疗药物对体外培养的视网膜母细胞瘤细胞的半数抑制浓度　　本实验通过CCK-8法检测视网膜母细胞瘤临床上常用的化疗药物长春新碱(Vincristine)、依托泊苷(Etoposide)化疗药物对体外培养的两株视网膜母细胞瘤细胞（SO-Rb50和Y79细胞）的半数抑制浓度，为后续研究基因和药物联合治疗视网膜母细胞瘤奠定理论基础。结果提示两种药物的半数抑制浓度分别为长春新碱0.02789μg/ml;依托泊苷0.4647μg/ml。　　九、实时定量PCR技术检测嗅素结构域基因家族（OLFM家族）成员OLFM2在视网膜母细胞瘤细胞系中的表达情况　　本实验通过实时定量PCR技术检测嗅素结构域基因家族（OLFM家族）成员OLFM2基因在不同细胞系的表达丰度，包括肝癌细胞系（HepG2细胞系）、视网膜母细胞瘤细胞系（SO-Rb50、Y79和WERI-RB1细胞系）和视网膜色素上皮细胞系（RPE细胞系）。结果提示OLFM2基因在视网膜母细胞瘤细胞系（SO-Rb50、Y79和WERI-RB1细胞系）和肝癌细胞系（HepG2细胞系）的表达丰度比在视网膜色素上皮细胞系（RPE细胞系）的表达丰度低。　　结论：　　本研究发现PAX6-RNAi-GFP慢病毒载体介导的人类视网膜母细胞瘤细胞（SO-Rb50和Y79细胞）内源性PAX6基因的抑制，可导致肿瘤细胞增殖速度加快和细胞凋亡率下降。内源性PAX6基因的抑制能使两株人类视网膜母细胞瘤细胞脱离相对静止的G1期，推进到对细胞周期特异化疗药物高度敏感的S期（SO-Rb50细胞）和G2/M期（Y79细胞），理论上PAX6基因与细胞周期特异化疗药物联合治疗视网膜母细胞瘤是可行的。我们的前期研究结果证明PAX6基因过表达可促进人类视网膜母细胞瘤增殖。这提示PAX6基因在视网膜母细胞瘤细胞（SO-Rb50和Y79细胞）表达丰度过高或过低都能引起视网膜母细胞瘤细胞生理代谢异常，导致肿瘤增殖加快。这表明PAX6基因的调节作用具有细胞特异性和剂量依赖性。另外，本实验通过实时定量PCR技术对嗅素结构域基因家族基因在视网膜母细胞瘤细胞系的表达丰度进行了探索，结果提示OLFM2基因可能对视网膜母细胞瘤的发生发展具有重要的作用。值得进一步探索和研究。