细胞基质是疫苗生产和检定所使用的主要载体,包括所有来自于动物或人源的原代细胞、二倍体细胞和连续传代细胞系。生物所目前生产用细胞基质为①二倍体细胞KMB17②连续传代细胞系(Vero细胞)。细胞基质的安全性与终产品的安全性密切相关。当这些细胞基质用于生产和检定时,需要通过细胞鉴别、外源因子检测在内的全面检定。生物所采用的细胞鉴别方法为细胞核型检查法。此方法能够鉴别人源细胞,但不能够分辨出形态相同的人二倍体细胞KMB17或MRC-5。STR位点的高度多态性使得不同个体具有特异性的STR图谱,其已广泛应用于亲子鉴定。STR-PCR法操作简单、特异性强、灵敏度高,是进行细胞鉴别和有无交叉污染的最简便有效的方法之一。本研究针对原来检定生物所细胞基质的方法不足,建立用STR位点进行细胞鉴别的方法。用STR-PCR方法对KMB17细胞进行细胞鉴定时,选取了19S433、D5S818、D21 S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSFIPO、PentaD、vWA、D8S1179、TPOX、PentaE、TH01、D12S391、D2S1338和FGA共19个常染色体位点和AMEL性染色体位点,进行了两次重复DNA分型测定。得到的STR图谱均完全相同,与中国食品药品检定研究院孟淑芳等报道的KMB17细胞的16个位点结果比对,16个位点的STR分型图谱完全相同,说明本研究中的检测样品就是KMB17细胞,DNA提取与检测操作过程以及检测结果具可行性和可靠性。Vero细胞鉴别,根据美国国家标准与技术研究院的Almeida等人研究报道参考选用了相应的STR位点:D8S1106、D1S518、D6S1017、D17S1304、D4S2408、D5S1467、D19S245 和 DYS389 进行。STR分型得到的图谱和重复序列的重复数与Almeida等报道的研究结果完全相同,表明我所疫苗生产用Vero细胞为正确细胞株,未被污染。进行检测的操作过程具有可重复性,检测结果准确可靠。外源因子污染是影响细胞基质安全性的一个重要的因素。在2015版《中国药典》细胞内、外源病毒因子检查中,规定有猪源性病毒的检测。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。具有特异性强,灵敏度高,操作简便、省时等特点。本研究通过合成猪圆环病毒(porcinecircovirus,PCV)及猪细环病毒(Torquetenosusvirus,TTSuV)的基因组序列,转化入pUC57载体质粒中作为阳性对照。以合成的阳性质粒为模版,对PCR的退火温度进行了优化,对方法的特异性及灵敏度进行了验证,初步建立了我所疫苗生产用原材料胰蛋白酶、细胞基质(包括生产用细胞KMB17、Vero和检定用细胞KMB17、Vero、MRC-5、Hep2、BT)及疫苗病毒收获液及成品的猪源性病毒PCR的检测方法。结果显示在检测的样品中没有检测到猪源性病毒的DNA片断;特异性验证:以克隆的PCV1、PCV2、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、TTSuVl 和 TTSuV 2 质粒互为对照,所建立的PCR方法均只能扩增出特异目的片段,其他质粒均无PCR产物扩增。灵敏度验证:将PCV、TTSuV重组质粒稀释,使其浓度为10ng/ul、lng/ul、l00pg/ul、10pg/ul、lpg/ul、100fg/ul、10fg/ul、lfg/ul、0.1 fg/ul,0.01 fg/ul,以其为模板进行PCR扩增,PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示PCV的最低检测限为0.lfg,即1.34×104个拷贝的PCV;TTSuVl最低检测限为10fg,即1.92×106个拷贝数;TTSuV2最低检测限为0.01fg,即1.94×103个拷贝数。这些结果显示,初步建立的检测方法具有特异性和一定灵敏度,可以用于我所疫苗生产的质量检定中。