M通道电流最早在1980年由Brown及Adams首次在牛蛙颈上交感神经节中发现。M通道是一种慢激活、慢去活、非失活的电压依赖型钾电流。M通道在众多类型神经元中有广泛分布，其中包括交感神经节、背根神经节及中枢神经系统神经元。目前人们认为Kv7通道家族成员(Kv7.2，Kv7.3，Kv7.5)构成的单聚体或异二聚体是构成M通道的分子基础。M电流与神经元的兴奋性密切相关。研究发现，Kv7.2或Kv7.3通道基因突变可诱发家族遗传性新生儿惊厥症（benign familial neonatalconvulsions, BFNC）等疾病。最近研究发现，神经元M电流还参与外周疼痛感觉的信号转导和神经性疼痛。因而，研究和开发Kv7钾通道的功能调节剂剂对于治疗这些诸如癫痫和疼痛等具有重要意义。以Kv7/M通道为分子作用靶点的新型抗癫痫化合物的研究已经成为神经科学领域的一大热点，并取得重要进展。瑞替加滨(Retigabine)就是具有代表性的一类新型抗癫痫药。临床前研究表明Retigabine具有广谱和强抗惊厥特性，对经传统药物治疗无效的顽固性癫痫患者有效。最近已在美国和欧洲上市，成为新类型的抗癫痫药。此外，Retigabine表现出较好镇痛作用，在慢性疼痛和神经性疼痛模型中均有效。氯普鲁卡因(chloroprocaine)是新一代酯类短效局部麻醉药，具有麻醉起效快、效应强、麻醉后恢复快等优点。而局麻药误入血液或过量使用均可引起严重的毒性反应。中毒反应早期症状为神经系统过度兴奋，如惊厥、抽搐等。局麻药过量或入血导致中毒副作用的机制较为复杂。局部麻醉药中毒是临床麻醉较为严重的并发症，其发生机制和预防与处理一直是人们关注的焦点。第一部分，我们对QO-58调节Kv7.2/Kv7.3通道作用特点进行研究。本实验室合成了针对Kv7.2/Kv7.3通道作用靶点的系列全新结构化合物，通过原子吸收Rb+流出测定的高通量筛选技术找到一系列有开放Kv7通道的作用的吡唑并嘧啶酮类化合物，其中化合物QO-58表现出较强的活性。第二部分，通过对近20种局麻药对Kv7.2/Kv7.3通道作用的筛选，我们发现新一代局麻药氯普鲁卡因能够抑制Kv7.2/kv7.3通道电流。第三部分，我们发现全新结构化合物SCR2682具有高效地激活Kv7.2/Kv7.3通道的作用，并对其抗癫痫作用进行研究。本论文以Kv7/M通道为研究出发点，观察了化合物QO-58、局麻药氯普鲁卡因和化合物SCR2682对其调节作用及特点。论文具体内容如下：第一部分化合物QO-58对Kv7/M钾离子通道的作用以及对神经元兴奋性和疼痛行为的影响目的：研究新型吡唑并[1，5-a]嘧啶酮类化合物QO-58对Kv7/M通道电流的作用及其机制；QO-58对DRG神经元兴奋性的影响；QO-58对大鼠疼痛行为的影响。方法：主要以两性霉素B为打孔剂的穿孔全细胞膜片钳技术，观察化合物QO-58对表达于HEK和CHO细胞中的Kv7通道电流的调节作用。利用电流钳模式观察药物对DRG神经元细胞膜电位以及细胞兴奋性的影响。利用坐骨神经慢性压迫疼痛模型观察QO-58对大鼠神经病理性疼痛行为的影响。结果：(1)化合物QO-58浓度依赖性增大Kv7.2/Kv7.3通道电流，EC50为2.3±0.8μM，Hill系数为0.6±0.1。QO-58（100μM）使Kv7.2/Kv7.3电流增大了6.15±0.76倍。QO-58浓度依赖性左移Kv7.2/Kv7.3通道电流-电压（I-V）激活曲线；给药前及给予0.1,0.3,1,3和10μM QO-58后，半数激活电压V1/2分别为-13.2±1.1mV,-23.9±1.5mV,-29.9±1.5mV,-38.9±1.4mV,-53.5±2.0mV和-58.2±1.7mV。拟合得到QO-58引起V1/2变化量的量效关系曲线，其EC50为1.2±0.2μM，Hill系数为1.2±0.3。QO-58能显著缩短通道激活时间常数并延长通道去活时间常数。在正常对照情况下，-40mV下通道激活段的时间常数为76.1±2.5ms，而给予QO-58（10μM）后变成179.5±25.8ms；而对于-120mV去活段电流，正常情况下其时间常数为28.3±6.3ms，而给与QO-58（10μM）后变成278.5±57ms。(2)-40mV激活电压下，QO-58(10μM)增大Kv7.1、Kv7.2、Kv7.4和Kv7.3/Kv7.5通道电流倍数分别为2.3±0.5,4.0±0.6,2.1±0.4,和1.1±0.6，但对Kv7.3通道增大幅度较低，仅为0.3±0.1倍。QO-58增大Kv7.1、Kv7.2、Kv7.4和Kv7.3/Kv7.5通道电流的量效曲线中，EC50值分别为7.0±1.0μM,1.3±1.0μM,0.6±0.1μM和5.2±2.2μM。QO-58(10μM)引起Kv7.1、Kv7.2、Kv7.4和Kv7.3/Kv7.5通道V1/2左移幅度分别为21.7±1.1mV,56.8±5.4mV,58.7±2.9mV和47.4±2.8mV，而引起Kv7.3通道V1/2改变仅为2.7±0.1mV。QO-58显著性延长Kv7.4和Kv7.3/Kv7.5通道激活时间常数，以及显著延长Kv7.1、Kv7.2、Kv7.4和Kv7.3/Kv7.5通道去活时间常数。QO-58将Kv7.2通道去活时间常数由15±1.5ms增大为96.4±12.5ms；将Kv7.4通道去活时间常数由8.7±0.2ms增大为316.6±125.8ms。(3) QO-58于-50mV激活电压下增大点突变体Kv7.2(W236L)电流1.6±0.4倍，并引起激活曲线显著左移，V1/2从-33.3±1.7mV改变为-92.8±2.7mV。点突变体Kv7.2(VVY224,225,226AIC (Kv7.2(AIC))通道半数激活电压V1/2为-81.0±2.2mV，给予QO-58和retigabine后Kv7.2(AIC)通道V1/2分别改变为-88.0±2.2和-95.5±1.7mV。QO-58将突变体Kv7.2(A306T)通道V1/2由从给药前的-46.3±1.2mV左移至-74.8±2.8mV，将突变体Kv7.2(L275A)通道V1/2由从给药前的-30.2±1.9mV左移至-67.5±3.5mV。(4)QO-58可以浓度依赖性地增大0mV下Kv7.1/KCNE1通道激活电流，EC50值为7.7±1.9μM，Hill系数为1.1±0.3。QO-58(10μM)仅增大0mV下豚鼠心室肌细胞Iks激活电流14.3±1.8%。QO-58(100μM)对豚鼠乳头肌动作电位时程毫无影响。(5) QO-58（10μM）能使背根神经节（DRG）神经元M电流增大25%，其作用强度与10μM retigabine相当。QO-58显著导致DRG神经元超极化，使其静息膜电位由-59.7±1.2mV超极化为-78.1±2.3mV。QO-58可以完全消除DRG神经元动作电位的爆发，显著降低神经元兴奋性。(6)腹腔注射给予QO-58（50mg/kg）可以显著提高手术后1-19天神经病理性疼痛模型大鼠的机械痛阈值及热痛阈值。结论：1. QO-58能够迅速且可逆地增大外源性表达于CHO细胞上的Kv7.2/Kv7.3通道电流。这种增大作用具有浓度依赖性，EC50值为2.3±0.8μM。QO-58浓度依赖性将Kv7.2/kv7.3通道I-V曲线向超级化电压方向移动，并且缩短通道激活和去活时间常数，改变通道动力学特征。2.QO-58能够剂量依赖地增大Kv7.1、Kv7.2、Kv7.4、Kv7.3/Kv7.5通道电流，并可将其I-V曲线向超级化电压方向移动，并且显著延长去活时间常数。但QO-58对Kv7.3通道作用较弱。3.氨基酸链Val224Val225Tyr226、氨基酸Arg306和氨基酸Leu275在QO-58激活Kv7.2通道过程中起重要作用。4. QO-58增大表达于HEK293细胞上Kv7.1/KCNE1通道电流。QO-58对豚鼠心室肌细胞Iks通道作用微弱，不影响豚鼠乳头肌动作电位时程。5. QO-58增大大鼠背根神经节M通道电流，引起神经元静息膜电位向超极化方向改变，并降低动作电位爆发频率。6. QO-58提高坐骨神经慢性压迫模型大鼠刺痛和热痛痛阈，具有用于治疗神经性疼痛的潜力。第二部分局麻药氯普鲁卡因对Kv7/M钾离子通道的调节作用及其与局麻药毒性作用的关系。目的：研究新一代局麻药氯普鲁卡因对Kv7/M通道电流的作用以及与其致惊厥作用的关系。方法：主要以两性霉素B为打孔剂的穿孔全细胞膜片钳技术，观察局麻药氯普鲁卡因对表达于HEK细胞中的Kv7通道电流的调节作用。利用电流钳模式观察氯普鲁卡因对DRG神经元细胞膜电位以及细胞兴奋性的影响。观察retigabine对局麻药氯普鲁卡因和布比卡因所致癫痫行为的影响。结果：(1)氯普鲁卡因浓度依赖性地抑制Kv7.2/Kv7.3电流。(2)氯普鲁卡因（10mM）将Kv7.2/Kv7.3通道的半数最大激活电压（V1/2）从-26.8±1.7mV右移至-16.1±1.3mV。氯普鲁卡因（10mM）能够显著延长Kv7.2/Kv7.3通道激活时间常数,并缩短通道去活时间常数；对照组在0mV下通道激活时间常数为26.9±3.9ms，给予氯普鲁卡因后延长至36.4±4.1ms；对照组-80mV下通道去活时间常数为71.3±24.7ms，给予氯普鲁卡因后缩短为65.0±15.0ms。(3)给予30mM氯普鲁卡因对+40mV激活电压下单聚体Kv7.2、Kv7.3通道和异聚体Kv7.2/Kv7.3通道电流的抑制率分别为23.2±5.2%,66.2±3.9%和34.8±1.1%。氯普鲁卡因使Kv7.2通道V1/2由-25.3±2.7mV右移至-15.4±2.9mV，使Kv7.3通道V1/2由-29.4±1.0mV右移至-17.8±1.2mV，使Kv7.2/Kv7.3通道V1/2由-28.4±1.7mV右移至-6.2±1.8mV。(4)氯普鲁卡因（30mM）能够引起神经元细胞膜电位由给药前的-64.6±0.1mV去极化至-48.1±0.1mV。给予retigabine使细胞膜电位超极化回复至-66.2±0.3mV。(5)腹腔注射给予Retigabine（20mg/kg）使氯普鲁卡因腹腔注射所致惊厥的发生率和死亡率的量效关系曲线右移，TD50值由166.1mg/kg改变为212.4mg/kg，LD50值由317.5mg/kg改变为433.3mg/kg。腹腔注射给予Retigabine（20mg/kg）同样使腹腔注射布比卡因所致惊厥的发生率和死亡率的量效关系曲线右移，TD50值由40.8mg/kg改变为51.5mg/kg，LD50值由58.5mg/kg改变为147.3mg/kg。结论：1.局麻药氯普鲁卡因抑制Kv7.2/Kv7.3通道电流，将Kv7.2/Kv7.3通道I-V曲线向去级化电压方向移动，并且延长通道激活时间常数和缩短去活时间常数。2.氯普鲁卡因抑制单聚体Kv7.3和异聚体Kv7.2/Kv7.3通道电流的作用强于其对Kv7.2通道电流地作用。3. Retigabine能够逆转氯普鲁卡因引起的M通道抑制以及神经元静息膜电位去极化。4. Retigabine显著增大氯普鲁卡因和布比卡因过量导致惊厥模型小鼠的TD50和LD50。第三部分化合物SCR2682对Kv7/M通道调节作用及对小鼠电惊厥的影响目的：研究新型化合物SCR2682对Kv7/M通道电流的作用。方法：主要以两性霉素B为打孔剂的穿孔全细胞膜片钳技术，观察化合物SCR2682对表达于HEK和CHO细胞中的Kv7通道电流的调节作用。利用电流钳模式观察SCR2682对DRG神经元细胞膜电位以及细胞兴奋性的影响。利用最大电刺激致惊厥模型观察SCR2682对小鼠电惊厥行为的影响。结果：(1)SCR2682浓度依赖性增大-40mV下记录的Kv7.2/Kv7.3通道电流，EC50为9.8±0.4nM，Hill系数为0.6±0.2。SCR2682（100nM）可使Kv7.2/Kv7.3通道激活电压向超极化方向移动，半数激活电压V1/2由3.1±3.0mV左移至-43.3±1.6mV。SCR2682（100nM）能显著延长通道激活时间常数以及通道去活时间常数。正常对照情况下，-40mV下通道激活段的时间常数为137.5±15.6ms，而给予SCR2682后则改变通道激活动力学特点，采用双指数方程进行拟合，t1为128.5±20.0ms，t2为510.1±50.3ms；而对于-120mV去活段电流，正常情况下其时间常数为21.8±4.3ms，而给与SCR2682后变成147.3±15.3ms。(2) SCR2682（100nM）使Kv7.2、Kv7.3、Kv7.4和Kv7.3/Kv7.5通道电流分别增加了4.7±0.4,1.7±0.03,2.9±0.3和1.9±0.1倍。SCR2682浓度依赖性增加Kv7.2、Kv7.3、Kv7.4和Kv7.3/Kv7.5通道电流，量效曲线的EC50值分别为26.3±1.3nM,11.2±2.3nM,28.8±8.7nM和11.1±1.0nM；Hill系数分别为1.0±0.03，1.4±0.7，1.0±0.2和1.2±0.1。SCR2682(100nM)分别引起Kv7.2、Kv7.3、Kv7.4和Kv7.3/Kv7.5通道半数激活电压V1/2由-16.7±1.2mV左移至-57.7±1.4mV，由-4.6±3.0mV左移至-48.1±2.5mV，由-0.1±2.5mV左移至-21.3±2.8mV,由-13.5±3.5mV左移至-47.9±3.7mV。(3)在对照以及给予SCR2682（100nM）和QO-58（10μM）后，点突变体Kv7.2（W236L）半数激活电压V1/2分别为-22.7±3.0mV、-25.4±4.2mV和-82.9±2.0mV。(4)100nM SCR2682能够显著增强DRG神经元M电流，其作用强度与10μM retigabine相当。SCR2682使DRG神经元静息膜电位由-56.7±2.8mV向超极化方向改变至-66.4±3.7mV。SCR2682可以完全消除神经元动作电位的爆发，显著降低神经元兴奋性。(5)腹腔注射给予SCR2682剂量依赖性降低小鼠最大电刺激导致的惊厥的发生率，ED50值为1.64±0.3mg/kg。结论：1. SCR2682浓度依赖性增大Kv7.2/Kv7.3通道电流，使Kv7.2/kv7.3通道I-V曲线向超级化电压方向移动，并且延长通道去活时间常数。2. SCR2682能够剂量依赖地增大Kv7.2、Kv7.3、Kv7.4、Kv7.3/Kv7.5通道电流，并使其I-V曲线向超级化电压方向移动，并且显著延长去活时间常数。3. SCR2682与retigabine作用位点相同。4. SCR2682增大大鼠背根神经节M通道电流，引起神经元静息膜电位向超极化方向改变，并降低动作电位爆发频率。5. SCR2682降低最大电刺激所致小鼠惊厥的发生率，具有用于治疗癫痫的潜力。总结：QO-58能够浓度依赖性增大Kv7.2/Kv7.3通道电流，将Kv7.2/Kv7.3通道I-V曲线向去级化电压方向移动，并且改变通道动力学特征。QO-58对Kv7.2和Kv7.4通道选择性强于Kv7.3通道。氨基酸链Val224Val225Tyr226、氨基酸Arg306和氨基酸Leu275在QO-58激活Kv7.2通道过程中起重要作用。QO-58能够降低动作电位爆发频率，降低坐骨神经慢性压迫模型大鼠刺痛和热痛痛阈，具有用于治疗神经性疼痛的潜力。局麻药氯普鲁卡因抑制Kv7.2/Kv7.3通道电流，将Kv7.2/Kv7.3通道I-V曲线向去级化电压方向移动，并且延长通道激活时间常数和缩短去活时间常数。Retigabine能够逆转氯普鲁卡因引起的Kv7.2/Kv7.3通道抑制以及神经元静息膜电位去极化。Retigabine显著增大氯普鲁卡因和布比卡因过量导致惊厥模型小鼠的TD50和LD50。Retigabine具有预防局麻药过量中毒的潜力。SCR2682浓度依赖性增大Kv7.2/kv7.3通道电流，将Kv7.2/kv7.3通道I-V曲线向去级化电压方向移动，并且延长通道去活时间常数。SCR2682增大Kv7.2、Kv7.3、Kv7.4、Kv7.3/Kv7.5通道电流。SCR2682与retigabine作用位点相同。SCR2682降低最大电刺激所致惊厥的发生率，具有用于治疗惊厥癫痫的潜力。