前列腺癌(prostate cancer, PCa)是常见的男性恶性肿瘤,在西方发达国家发病率高,仅次于肺癌。我国虽是前列腺癌发病率较低的国家,但近年来随着人口老龄化、饮食生活习惯、环境因素等变化,其发病率迅速升高。前列腺癌是雄激素/雄激素受体依赖性肿瘤,因此通过睾丸切除、或使用抗雄激素药物等降低体内的雄激素水平而进行的内分泌治疗是治疗前列腺癌的首选方案,但大多数患者会在治疗后一年左右复发,并发展成为激素难治性前列腺癌(Hormone Refractory Prostate Cancer, HRPC)。HRPC具有较强的抗凋亡能力,易侵袭转移,预后差、死亡率高。尽管已对HRPC的演变进行了诸多深入系统的研究,但机制仍不完全清楚,也无有效的治疗策略。因此研究HRPC的恶性转化机制、寻找有效的治疗靶点依然是任重而道远。除了雄激素/雄激素受体依赖途径、非依赖途径在HRPC发生发展中的重要作用,近年来,慢性炎症在前列腺癌的发生、HRPC的演变过程中的重要性日益凸显。由于前列腺癌几乎都发生在外周区,与慢性前列腺炎的发生部位相同。在炎症反应中发挥重要作用的基因, MIC-1(Macrophage Inhibitory Cytokine-1, or growth differentiation factorl5), RNASEL, MSR-1(macrophage scavenger receptor1), TLR-4(Toll-like receptors4)等,因其基因型的改变参与前列腺癌的发生。而在前列腺癌恶性发展、侵袭转移过程中,肿瘤微环境中促炎细胞因子IL-6, TNF-a, IL-1等,发挥促进细胞存活增殖、血管形成的作用。其中IL-6是关键因子,可诱导产生Thl7的CD4+T细胞,后者拮抗具有肿瘤抑制作用的Thl CD4+T细胞；作为具有促瘤作用的炎性因子,IL-6可通过IL-6/gp130激活STAT3途径发挥促细胞增殖、抗凋亡作用。临床资料显示,IL6、MIC-1在转移性的前列腺癌患者血清中表达水平显著升高,在前列腺肿瘤的恶性发展过程中可能具有重要作用。另外,两条重要的炎症中枢信号途径IKK/NF-κB、JAK/STAT3,同时也是细胞增殖存活信号,在HRPC中均高表达、持续活化,与HRPC的抗凋亡、侵袭转移、预后差密切相关。因此,慢性炎症反应通过NF-κB、STAT3等信号促进前列腺癌的发生,而持续活化的NF-κB、STAT3进一步诱导产生炎症因子如IL6,形成循环活化,促进HRPC的形成,导致HRPC患者血清中IL6水平显著升高。炎症反应与前列腺癌化疗耐受的研究报道不多。已发现HRPC患者血清中IL-6、MIC-1水平增高与多西紫杉醇的耐药有关。由于慢性、复发性炎症在前列腺肿瘤的发生、侵袭转移、药物耐受等方面都发挥重要作用,因此,靶向炎症因子及其相关通路的治疗策略具有重要的理论和临床意义。如利用人源化的单克隆抗IL-6抗体CNTO328阻断IL-6作用,能显著抑制激素依赖前列腺癌LNCaP细胞增殖,同时抑制移植瘤生长。同样,趋化因子CCL2可促进巨噬细胞在肿瘤的浸润及极化为M2型,利用抗CCL2的抗体以及联用多西紫杉醇能显著提高HRPC的治疗效果并延长生存期。近年来,我们重点对源自苔藓植物的双联苄(Bisbibenzyls)化合物进行了系统的生物活性筛选,发现这类化合物毒性较低、具有良好的抗真菌、抗肿瘤活性。同时也对潜力化合物进行较为深入的作用机制研究、结构修饰、衍生物制备等。前期研究结果发现,某些联苄化合物可能具有一定的抗炎活性。基于上述研究,本论文对51种联苄化合物及其衍生物、结构修饰产物进行了系统的抗炎活性筛选,并通过结构特点、化合物的理化性质分析其与抗炎活性的关系。发现片叶苔素类化合物抗炎活性较弱,而地钱素类联苄化合物特别是地钱素M(Marchantin M, Mar M)的抗炎活性显著,而且Mar M可显著抑制前列腺癌细胞的侵袭转移。结合基因表达差异谱芯片数据及机制分析,发现Mar M可显著上调G蛋白信号途径调节蛋白4(Regulators of G-protein signaling4, RGS4), RGS4可抑制MMPs的表达、进而在侵袭转移过程中发挥重要作用。并且抑制IL6信号可更为显著增加Mar M诱导的RGS4的表达。本论文将分两部分研究Mar M的抗炎、抑制前列腺癌侵袭转移的作用机制。第一部分地钱素M抑制促炎因子的表达,提高前列腺癌细胞对多西紫杉醇的敏感性本课题组前期已对几百个联苄化合物进行抗肿瘤活性筛选,并对部分潜力化合物进行了较为深入的机制研究。同时也发现个别双联苄化合物可能具有一定的抗炎活性。本论文首先利用脐静脉内皮细胞(HUVEC)和外周血单核细胞(PBMC)为筛选模型,对51种联苄化合物进行了抗炎活性的筛选,其中也包括部分具有抗肿瘤活性的联苄化合物、衍生物、结构修饰化合物。发现地钱素M具有显著的抗炎活性,而且对肿瘤细胞的促炎因子也同样具有良好的效果。具体实验结果如下：1.地钱素类化合物具有良好的抗炎活性我们利用脐静脉内皮细胞(HUVEC)和外周血单核细胞(PBMC)为模型,以经典的促炎因子IL6为检测指标,对两种结构类型(片叶苔素类、地钱素类)的51种联苄化合物及其衍生物进行抗炎活性分析。ELISA和定量PCR实验结果显示,地钱素类双联苄化合物可以有效抑制HUVEC细胞中IL6的表达,而片叶苔素类化合物对IL6的表达无显著影响。其中地钱素M的抑制IL6的活性最为显著。2.地钱素M抑制多种炎症因子的表达抗炎活性筛选结果表明,地钱素M在所有筛选化合物中活性最高,对IL6的抑制率为34.3%,显示出良好的抗炎活性。ELISA和定量PCR实验结果进一步表明,地钱素M可以显著抑制HUVEC中ILlβ、IL6和CCL2的表达,且具有浓度和时间依赖性。PBMC细胞经LPS刺激后炎症因子表达增加,而地钱素M可显著抑制LPS刺激后的IL1β、IL6和CCL2的表达,片叶苔素化合物的抑制作用较弱。MTT结果显示,地钱素M具有抗炎作用的实验条件(作用浓度和时间)对正常的HUVEC细胞的增殖并无明显的抑制作用,进一步证实地钱素M可显著抑制促炎因子的表达。3.地钱素M显著抑制肿瘤细胞促炎因子的表达由于地钱素M具有良好的抗肿瘤活性,我们进一步分析地钱素M是否对肿瘤细胞也具有抗炎活性。激素非依赖的前列腺癌PC3细胞表达较高水平的炎症因子,地钱素M显著下调细胞中IL1β、IL6和TNFa的表达、抑制炎性因子的分泌,且呈时间和剂量依赖性。同样,地钱素M能够显著下调激素非依赖的前列腺癌DU145细胞、白血病K562细胞、肺癌H460细胞、以及结直肠癌HT一29细胞中IL6的表达和蛋白分泌,表明地钱素M对肿瘤细胞也具有良好的抗炎活性。4.地钱素M的抗炎机制分析由于地钱素M对多种促炎因子均有抑制作用,而炎症的中枢信号IKK/NF-κ B、JAK/STAT3在HRPC中均高表达、持续活化,与HRPC的抗凋亡、侵袭转移等密切相关,NF-κB/STAT3同时也是重要的转录因子,可介导多种下游靶基因的表达。因此我们分析NF-κB/STAT3信号通路是否参与地钱素M介导的抗炎活性。(1)地钱素M显著抑制LPS刺激后的HUVEC中p50和p65的表达：NF-κB与DNA的结合能力是其发挥作用的重要方式。NF-κB中的两个亚基p50和p65的DNA结合活性检测结果表明, HUVEC细胞经LPS刺激后p50和p65的DNA结合能力显著增加,而地钱素M可显著抑制p50和p65的结合活性、抑制NF-κ B的转录激活功能。(2)地钱素M显著抑制肿瘤细胞中IκBα/NF-κB的活化：Western blotting实验结果表明,地钱素M不仅可以抑制PC3细胞(NF-κB基础表达水平高)中NF-κB亚基p65的磷酸化,也可抑制NF-κB的抑制因子Ⅰκ B α的磷酸化水平。同时,地钱素M也可显著抑制H460和HT-29细胞(NF-κB基础表达水平低)中经LPS诱导激活的p65和I K B α的磷酸化水平,表明地钱素M可抑制持续活化、或者诱导激活的NF-κB的活性。(3)地钱素M可能是通过抑制IKK的活性进而抑制NF-KB的活性：在PC3细胞中,利用干扰RNA下调IκBα的表达后,可略微逆转地钱素M抑制p65磷酸化的作用,表明I K B α可能不是地钱素M抑制p65活性的主要靶点。此结果提示,地钱素M可能部分抑制了IKK的活性,从而导致I K B α磷酸化水平降低、依赖磷酸化降解的I K B α降解减少并抑制NF-κB的活化。(4)地钱素M显著抑制STAT3的活化：STAT3是位于NF-κB/IL6信号通路下游的重要介质,Western blotting实验结果表明,地钱素M不仅可以抑制PC3细胞中STAT3的磷酸化水平,还可抑制H460和HT-29细胞中经LPS刺激后显著上调的phospho-STAT3。而干扰iκBa后,并不显著逆转地钱素M对STAT3的磷酸化抑制作用,表明地钱素M也可通过其它机制抑制STAT3的活化。5.地钱素M的抗炎活性可增加前列腺癌细胞对多西紫杉醇的敏感性由于多西紫杉醇可显著增加肿瘤细胞中IL6的表达,我们利用流式分析技术检测地钱素M的抗炎活性是否能够提高细胞对多西紫杉醇的敏感性。结果显示,单纯使用中和抗体可封闭IL6介导的信号,但并不显著增加PC3和DU-145细胞对多西紫杉醇的敏感性。而联用地钱素M和多西紫杉醇后,细胞的凋亡率明显上升。另外细胞增殖实验结果表明,随着多西紫杉醇作用浓度的加大,PC3和DU-145的生存率逐渐降低,而若联用地钱素M后,对细胞的生存能力产生非常显著的协同抑制作用。因此,地钱素M对多种促炎因子的抑制作用可显著增加前列腺癌细胞对多西紫杉醇的敏感性。第二部分地钱素M通过上调RGS4、下调MMPs的表达而抑制前列腺癌细胞的侵袭转移由于促炎细胞因子IL-6, TNF-a, IL-1等对肿瘤细胞的增殖、血管形成、侵袭转移等都具有显著的促进作用。因此,本论文第二部分将分析具有抗炎活性的地钱素M对前列腺癌细胞侵袭转移能力的影响并对其机制进行初步探讨。研究表明,G蛋白信号途径调节蛋白(Regulators of G-protein signaling, RGS)家族成员和肿瘤的血管生成、转移以及细胞凋亡等诸多活动有密切关联。其中RGS4被报导在乳腺癌和卵巢癌中的表达与肿瘤细胞的恶性程度呈负相关,该蛋白在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达上调可以显著抑制肿瘤细胞的侵袭转移。目前尚未有文献报导RGS4在前列腺癌中的表达和功能。前期的基因表达差异谱数据显示,地钱素M可影响多个RGS蛋白的表达,本论文也将探讨RGS4是否参与地钱素M抑制细胞侵袭转移过程,并初步分析IL6是否也参与其调节过程。1.地钱素M显著抑制PC3细胞的迁移能力和侵袭能力前期结果表明,地钱素M能非常显著的抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。我们首先确定地钱素M对肿瘤细胞侵袭转移的影响。划痕实验和Transwell细胞体外侵袭实验表明,地钱素M可以显著抑制PC3细胞迁移的距离和转移到下室的细胞数量。而且其抑制细胞移动的作用显著高于多西紫杉醇(可增加IL6表达)、无抗炎活性的顺铂。2.地钱素M显著上调RGS4的表达基因芯片分析结果显示,地钱素M对18种RGS基因的表达都有较大影响。其中RGS4上调2.26倍。定量PCR验证结果表明,地钱素M可以显著上调RGS4的表达。另外,Western blotting实验和定量PCR结果表明,RGS4在前列腺正常上皮细胞RWPE1中高表达,在恶性程度较低的激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP中表达量较高,在恶性程度较高的激素非依赖性前列腺癌PC3和DU-145中表达量低,提示我们RGS4的表达量高低可能与前列腺癌的恶性程度有关。3.地钱素M上调RGS4的同时显著下调MMP7和MMP16由于NF-κ B的下游靶基因如MMPs等具有促进细胞侵袭转移的作用,我们分析地钱素M对MMPs表达的影响。恶性程度较高的PC3和DU145细胞经地钱素M处理后,细胞内MMP7和MMP16的mRNA水平显著下调,同时Western blotting也显示地钱素M显著抑制MMP7和MMP16的蛋白水平,同时,也明显上调RGS4的表达。4.RGS4能显著增强地钱素M对细胞MMP7和MMP16表达的抑制作用我们将质粒pcDNA3.1-RGS4转入PC3细胞使其过表达RGS4,再经地钱素M处理,结果显示,高表达RGS4可以抑制MMP7和MMP16的表达,再与地钱素M联用后,MMP7和MMP16的下调趋势变得更为明显。此结果表明,RGS4可抑制MMPs的表达,可增强地钱素M抑制细胞迁移的作用。5.RGS4显著增强地钱素M对细胞侵袭转移的抑制作用划痕实验和Transwell细胞体外侵袭实验结果显示,RGS4可以显著抑制PC3细胞的迁移能力和侵袭能力,而过表达RGS4后细胞再经地钱素M处理后,PC3细胞迁移的距离和转移到下室的细胞数量下降更加明显。因此,RGS4可负调控细胞的侵袭转移、增强地钱素M的抑制作用。第三部分结论及创新点一、结论1.地钱素类双联苄化合物可显著抑制正常细胞和多种恶性肿瘤细胞的促炎因子活性。2.地钱素M显著抑制NF-κB/IL6/STAT3信号通路。3.地钱素M的抗炎活性提高了前列腺癌细胞对多西紫杉醇的敏感性。4.在半数抑制浓度下,具有抗炎活性的地钱素M比无抗炎活性的多西紫杉醇、顺铂具有更为显著的抑制细胞侵袭转移的能力。5.上调RGS4参与地钱素M抑制MMP7和MMP16表达、抑制细胞的侵袭转移。二、创新点与不足之处1.首次报导地钱素M具有显著抗炎活性,且地钱素M介导的抗炎活性可能是由于抑制NF-κB/IL6/STAT3信号通路而增强多西紫杉醇的功效。但该化合物抗炎活性的动物药效学实验尚需进行。2.首次报导地钱素M通过下调MMP7和MMP16的表达显著抑制激素非依赖性前列腺癌细胞PC3的侵袭转移,但具体机制有待于进一步研究。3.首次报导RGS4通过下调MMP7和MMP16的表达显著抑制细胞的侵袭转移,但具体机制有待于进一步研究。