以Ⅱ型组织相容性抗原复合物为基础的抗原呈递需要将天然蛋白加工成短肽以适应MHC的结合和T细胞受体的识别。抗原呈递细胞中进行的抗原加工涉及抗原的变性、去折叠、二硫键的还原及蛋白质的水解,其中二硫键的还原是至关重要的步骤。GILT(全称γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶)具有还原二硫键的活性,因此能够促进天然蛋白抗原的去折叠和进一步蛋白酶解。在专门的抗原呈递细胞中,GILT在低pH条件下有着较高的活性,并且在抗原加工及免疫显性表位显示中起重要作用。另外,GILT在中和胞外病原体和清除感染细胞碎片方面也有作用。近来研究表明,GILT在细胞中的缺失与表达会影响到对病毒、肿瘤、细菌、抗原等的免疫应答,并且可能影响自身免疫疾病的发生发展。例如,GILT在T细胞中的表达会降低T细胞的敏感性并且降低自身免疫应答。GILT是李斯特氏菌的关键宿主因子,会引起鱼类、鸟类及哺乳类动物致病。这些均表明GILT可以被应用于医学研究领域及治疗自身免疫性疾病,从而为新的预防与治疗疾病提供一定的参考价值。溶菌酶(LYZ)是一种碱性球蛋白,酶的活性中心是天冬氨酸和谷氨酸。LYZ是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,亦称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质肽聚糖水解酶,它能够专一地作用于肽聚糖分子中的β-1,4-糖苷键,从而破坏细菌的细胞壁,最终使细菌裂解死亡。溶酶体是一种先天性免疫系统的组成部分,主要由单核巨噬细胞分泌产生,在机体中起着非特异性的防御作用,它具有抗菌、消炎、抗病毒等多种作用。作为一种无毒副作用的人体内蛋白质,溶菌酶是一种比较安全的食品保鲜剂和防腐剂,已成为科研领域的研究热点。第一部分:豚鼠和罗非鱼GILT基因结构、表达及其生物学活性分析。通过RT-PCR分别从豚鼠、罗非鱼脾脏组织中扩增得到了 705bp的Cavia porcellus GILT(cpGILT)和756bp的Oreochromis niloticus GILT基因(onGILT)。CpGILT基因的CDS区编码234个氨基酸,在线预测其相对分子质量为25.85 kDa;OnGILT基因的CDS区编码252个氨基酸,在线预测其相应蛋白质的分子量约为27.8kD,等电点理论值PI=5.86。通过软件预测三维结构显示onGILT以及cpGILT和人、鼠GILT的结构相似。两者GILT蛋白质均包含有GILT蛋白的特征序列:CXXC和CQHGX2ECX2NX4C,且进化分析表明两者GILT和与其他物种的GILT起源于同一祖先。荧光定量PCR实验表明,两者GILT的表达均具有组织特异性,并且经过LPS刺激后表达量在脾脏和肾脏组织中得到上调。我们通过构建融合表达载体,高效表达了重组蛋白质PET28a-cpGILT和PET28a-onGILT,并对其进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。接着以人IgG为底物,测定了 cpGILT和onGILT的巯基还原酶活性。最后,通过细胞转染及免疫荧光技术,采用亚细胞定位分析了cpGILT/onGILT和hGILT的定位。实验结果表明,cpGILT和onGILT均能够还原二硫键,对动物机体的天然免疫防护具有重要作用,cpGILT/onGILT的亚细胞定位与hGILT相类似,并且它们的定位与抗原呈递细胞中发现的定位是相一致的,这为以后探究GILT在鱼类和哺乳动物中的新作用提供了参考和依据。第二部分:家兔LYZ的基因结构、表达及其生物学活性分析。本文以家兔作为研究对象,利用Trizol法从家兔脾脏组织中提取RNA,经过RT-PCR 扩增得到长为 432bp 的 Oryctolagus cuniculus LYZ 基因(ocLYZ),ocLYZ 基因CDS区编码144个氨基酸,在线预测其相对分子质量为16.17kDa,并利用MEGA软件分析了其进化地位。通过荧光定量PCR对LYZ基因在不同组织中的表达进行了分析,利用基因工程技术,构建重组表达载体PET28a-ocLYZ,诱导表达了融合蛋白质,并运用孔穴法对其生物学活性进行测定,最后探究了 ocLYZ的最佳作用pH和温度。这些结果表明,ocLYZ具有抑菌作用,对机体的天然免疫防护有重要作用,这也为进一步研究溶菌酶奠定了基础,提供新的研究依据,供人们更充分地加以利用。