新型光敏剂DTPP对肿瘤细胞光动力杀伤效应及细胞骨架观察

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目的探讨新型光敏剂DTPP在650nm波长激光激发下,对人乳腺癌MCF-7细胞体外光动力杀伤效应,研究新型光敏剂DTPP介导的光动力疗法的体外杀伤效应,探讨细胞骨架变化在细胞凋亡中的作用。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法检测经不同浓度DTPP(0、2、4、6、8、10、12、15、20、25、30μg/mL)、不同能量(0、0.6、1.2、2.4、4.8、7.2、9.6J/cm2)激光照射的人乳腺癌MCF-7细胞的光密度(OD)值,探讨不同浓度光敏剂和不同能量光照对细胞增殖影响;以不同能量(1.2、2.4、4.8J/cm2)激光照射8μg/mLDTPP孵育的细胞,在荧光显微镜下利用DAPI染色观察细胞核形态变化,流式细胞仪检测PI单染细胞,探讨细胞凋亡和周期阻滞现象;采用浓度为6μg/mL的光敏剂DTPP与MCF-7细胞共同孵育24小时后,用7.2J/cm2激光垂直照射细胞,测定PDT后不同时间内细胞的光密度(OD)值变化,用Annexin V/PI双染探讨细胞凋亡和坏死,单细胞凝胶电泳实验观察细胞DNA断裂情况,以明确细胞凋亡发生;采用免疫荧光染色法荧光显微镜下观察细胞骨架形态改变,Western Blotting法检测相关凋亡蛋白和细胞骨架蛋白变化,进一步阐明DTPP介导的光动力治疗抑制乳腺癌细胞增殖。结果新型光敏剂DTPP介导的光动力治疗对MCF-7细胞有明显的杀伤效应,随着DTPP-PDT时间的延长,细胞生存率随之下降。DTPP-PDT后的细胞染色质分布不均匀,可见凋亡特征性表现,细胞出现核固缩,甚至核碎裂,染色质浓集,呈颗粒状或团块样分布;细胞周期显示G0/G1期细胞比例明显增加,细胞周期进程减慢。流式细胞仪(FCM)分析结果显示,细胞凋亡率与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),其凋亡率随着DTPP-PDT时间延长而升高,且以晚期凋亡为主;彗星图像可见明显慧尾存在,提示细胞DNA发生断裂。显微镜下细胞骨架观察显示,DTPP-PDT后细胞骨架排列紊乱,发生重排,微丝、微管部分消失,出现异形细胞,随着时间延长,这一变化趋于明显。Western blotting结果显示,DTPP-PDT后不同时间点,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,细胞骨架结合蛋白β-Catenin表达明显降低,细胞骨架蛋白β-Actin比β-Tubulin减少,但相较于内参GAPDH变化不明显。结论光敏剂DTPP具有低毒高效的特点,其介导的光动力疗法对人乳腺癌MCF-7细胞具有光动力杀伤效应,且呈现出剂量时间依赖性,DTPP-PDT可以诱导细胞产生典型的细胞凋亡,虽然光动力效应发生在激光照射光敏剂的短时间内,但是其诱导肿瘤细胞的凋亡是一个渐进性过程。细胞骨架是细胞的重要组成部分,凋亡时细胞骨架改变可以引起细胞形态和细胞结构的变化。其杀伤效应与细胞凋亡蛋白和细胞骨架蛋白表达变化密切相关。
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