研究背景：间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是存在于骨髓和其他多种组织中的成体干细胞。MSCs具有广泛的免疫调控作用,目前已在临床上应用于移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)和自身免疫性疾病等的治疗。慢性GVHD (chronic GVHD, cGVHD)是影响异基因造血干细胞移植(]hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)效果的主要并发症,其临床表现与多种自身免疫性疾病类似。有研究报道MSCs在部分自身免疫性疾病中存在衰老、凋亡和增殖能力减弱等现象,可能参与了疾病的发病过程。cGVHD患者MSCs是否也有类似现象,能否用自体MSCs进行细胞治疗尚不明确。MSCs发挥免疫调控作用需要炎性微环境的激活。然而,在炎性细胞因子作用下,MSCs出现损伤并增加免疫原性,限制了其在GVHD等多种疾病中的治疗作用。mTOR信号途径参与调控多种免疫反应,对T细胞、B细胞激活和分化等具有重要的调控作用。另外,mTOR信号途径还参与调控B16黑色素瘤细胞等表面MHC分子的表达。然而,在MSCs中mTOR信号途径是否能调节免疫抑制能力和免疫原性尚不清楚。本研究旨在阐明MSCs在cGVHD发生发展中的作用,并探讨自体MSCs治疗cGV HD的可行性；探讨mTOR信号途径对MSCs免疫抑制能力和免疫原性的调节作用及具体机制,为改善MSCs治疗GVHD等疾病奠定实验基础。第一章慢性移植物抗宿主病患者骨髓间充质干细胞生物学特性研究目的：比较分析HSCT后cGVHD患者和无cGVHD患者骨髓MSCs的表型和功能,阐明MSCs在cGVHD发生发展中的作用；进一步与正常供者骨髓MSCs比较,探讨cGVHD患者MSCs用于自体移植的可行性。方法：分离培养25例异基因HSCT后cGVHD患者,16例无cGVHD患者和19例正常供者的骨髓MSCs,取第3-5代细胞进行比较分析。短串联重复序列(STR)-PCR检测HSCT后骨髓MSCs来源；成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)培养法检测MSCs在骨髓中的数量；流式细胞术检测细胞表面标记、凋亡和免疫抑制能力；茜素红染色和油红O染色分别检测MSCs成骨和成脂分化能力；衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测细胞衰老；ELISA检测MSCs正常培养和与外周血单个核细胞(PBMCs)共培养后免疫抑制因子分泌水平；荧光定量PCR检测多能性相关基因、衰老相关基因和分化相关基因表达水平；Transwell实验检测MSCs迁移能力。结果：HSCT后cGVHD患者和无cGVHD患者骨髓MSCs都来自患者自身。MSCs表面都强表达CD73、 CD90、 CD105,中等表达HLA-ABC,不表达CD34、 CD45、 CD11b、 CD19和HLA-DR。两组MSCs在骨髓中的数量相当,具有相似的细胞形态、增殖和自我更新能力、分化潜能和迁移能力。MSCs的细胞衰老和凋亡百分比也无明显差异。两组MSCs的免疫抑制能力无明显区别,都能显著抑制植物凝集素(PHA)活化的PBMCs增殖；与CD4+T细胞单独培养相比,MSCs与CD4+T细胞共培养后,能明显增加CD4+CD25hiCD127-Tregs的比例；MSCs正常培养或与PBMCs共培养后免疫抑制因子TGF-p1、 IL-10、 HGF、 PGE2的分泌水平也类似。另外,与正常供者骨髓MSCs相比,尽管cGVHD组MSCs在骨髓中的数量减少,而在表型和其他功能方面均无显著差别。结论：MSCs不参与cGVI ID的发生发展,cGVHD患者MSCs具有正常的表型和功能,可能适用于自体细胞治疗。第二章nTOR信号途径调节骨髓间充质干细胞免疫抑制能力的作用及机制目的：阐明mTOR信号途径对骨髓MSCs免疫抑制能力的调节作用及其机制。方法：MSCs预处理不同浓度雷帕霉素后与活化的PBMCs、小鼠脾细胞以及CD4+T细胞共培养5天,流式细胞术分别检测PBMCs、小鼠脾细胞增殖率和CD4+CD25hiCD127-细胞比例。荧光定量PCR检测IFN-γ、 TNF-a受体和免疫抑制因子mRNA表达水平；Western blotting检测COX-2、 mPGES-1等蛋白表达水平；慢病毒介导的shRNA干扰验证COX-2在MSCs免疫抑制中的作用；ELISA检测雷帕霉素预处理后MSCs培养上清PGE2的分泌水平。结果：雷帕霉素预处理抑制mTOR信号途径后显著增强MSCs对PBMCs增殖的抑制作用,对诱导Tregs作用没有明显影响。雷帕霉素预处理后,MSCs也能明显抑制抗CD3/CD28抗体活化的小鼠脾细胞增殖。抑制mTOR信号途径不影响炎性细胞因子IFN-γ、 TNF-a受体的表达,但能显著提高COX-2的mRNA和蛋白水平以及PGE2分泌水平。IFN-γ、 TNF-a也增强COX-2和PGE2的表达,雷帕霉素预处理后能在炎性细胞因子作用基础上进一步上调。加入COX-2特异性抑制剂NS-398或shRNA干扰后能减弱雷帕霉素对MSCs免疫抑制的促进作用。雷帕霉素引起MSCs中NF-κB入核,加入NF-κB抑制剂PDTC后雷帕霉素对COX-2蛋白表达的上调作用减弱。结论：雷帕霉素预处理抑制mTOR信号途径后通过上调MSCs的COX-2和PGE2表达增强免疫抑制作用。第三章mTOR信号途径调节骨髓间充质干细胞免疫原性的作用目的：阐明mTOR信号途径对骨髓MSCs表面HLA-ABC和HLA-DR表达的调节作用。方法：雷帕霉素预处理MSCs,正常培养或IFN--γ作用不同时间后流式细胞术检测细胞表面HLA-ABC+、HLA-D R+细胞比例和平均荧光强度；荧光定量PCR检测IRF1、CIITA以及蛋白酶体亚单位和MHC-I类分子组装相关分子伴侣的nRNA表达水平；Western blotting检测Statl蛋白磷酸化水平。结果：雷帕霉素处理对MSCs表面的HLA-ABC表达没有影响。IFN-γ处理3天后明显增强HLA-ABC平均荧光强度,并上调蛋白酶体亚单位LMP2、LMP7、LMP10以及分子伴侣Tapasin等的mRNA表达水平。雷帕霉素对IFN-γ作用下的HLA-ABC表达也没有影响,但能提高Tapasin、 LMP7和LMP10的表达水平。MSCs正常条件下不表达HLA-DR,但在IFN-γ作用下表达明显上升。IFN-γ作用后Statl蛋白的磷酸化水平和IRF1、CIITA的mRNA表达水平也明显上升。雷帕霉素对Statl磷酸化水平和IRF1、CIITA的表达水平没有影响,然而高浓度雷帕霉素预处理能显著减弱IFN-7处理后的HLA-DR+细胞比例以及平均荧光强度。结论：雷帕霉素抑制mTOR信号途径不影啊HLA-ABC表达,但能减弱IFN-γ作用后的HLA-DR表达。