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目的:腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒,人腺病毒(ADV)有六组51个血清型,能引起不同器官的多种疾病。在正常人群中,腺病毒感染能引起呼吸道疾病、结膜炎、胃肠炎、出血性膀胱炎等。在骨髓移植患儿中,由腺病毒诱发的死亡率高达50~80%。目前尚无有效的抗腺病毒治疗药物。本文将2005年11月~2006年3月哈尔滨地区儿童呼吸道感染患者的咽拭子标本分离纯化的人腺病毒株进行全基因组测序,并对肉桂醛抗该测序的人腺病毒作用进行研究。为了解哈尔滨地区腺病毒的流行毒株,开展有关腺病毒感染流行病学、病原学等研究,开发特异性强而副作用小的抗腺病毒药物,建立合适的防治策略和开展治疗腺病毒感染的研究具有重要的意义。
方法:将临床标本分离纯化的腺病毒株接种于HeLa细胞进行病毒培养,提取腺病毒DNA,以GENEBANK上传的AY599834(3型)和AY594255(7型)序列为理论序列设计18对引物,PCR扩增腺病毒DNA目的片段,将PCR阳性产物克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。通过水蒸气蒸馏法提取肉桂油,用气相色谱-质谱联用仪进行肉桂油成分分析,选取肉桂油主要成分肉桂醛进行抗腺病毒研究。采用细胞病变抑制实验(CPE)和噻唑蓝(MTT)比色法观测肉桂醛抗ADV作用;利用原子力显微镜观察ADV与药物直接作用后病毒形态学的改变。免疫组织化学法和Western blot检测肉桂醛抗腺病毒对Hexon蛋白表达、细胞凋亡、caspase-3蛋白和caspase-8蛋白表达的影响。
结果:(1)分离纯化的腺病毒株六邻体(Hexon)测序结果与GenBank发表的ADV序列进行初步同源性分析,发现该腺病毒株(Hexon)与腺病毒7型最为接近,六邻体核苷酸同源性为98%。其病毒种类有待进一步全基因序列同源性分析研究。(2)肉桂油的收率为1.96%,鉴定了肉桂油中的10种成分,主要为肉桂醛,占总馏出峰面积的93.94%,肉桂醛纯度>96.24%。(3) MTT结果肉桂醛在三种作用方式(除细胞保护作用方式)下能够抑制腺病毒生长,病毒抑制率与药物浓度呈正相关,肉桂醛对宿主细胞无保护作用,不能阻断病毒进入细胞。(4)原子力显微镜结果肉桂醛组ADV体积变小(40nm),表面不光滑,形态不规则。(5)肉桂醛(除细胞保护作用方式)组与病毒组比较细胞凋亡水平、Hexon蛋白、Caspase-3蛋白和caspase-8蛋白的表达明显降低(P<0.05)。
结论:测序的腺病毒株可能为7型腺病毒株。肉桂醛有抗ADV作用,作用方式主要是对病毒的直接灭活作用、抑制病毒吸附作用和病毒复制作用,但却对宿主细胞无保护作用。在三种作用方式下(直接灭活阶段、病毒复制阶段、病毒吸附阶段),肉桂醛抗ADV作用可能与减少细胞凋亡、调节Hexon蛋白、Caspase-3蛋白和caspase-8蛋白的表达有关。本次研究结果为哈尔滨地区腺病毒感染的防治提供理论基础,为研发天然、高效、低毒的抗腺病毒的药物提供了科学依据,为植物药的开发和利用,促进我国经济植物的研究与利用提供了新的思路。