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类鼻疽是由类鼻疽杆菌(B.pseudomallei)引起的一种热带疾病,广泛分布于南北纬度20°间地区。我国海南、广东、广西等地都是类鼻疽的疫源地。类鼻疽不仅被美国CDC列为I类生物恐怖源,也是我国入境动物检疫疫病名录中规定的二类动物疫病之一。目前还没有疫苗可用,即使经抗生素治疗,类鼻疽的死亡率也高达40%。鉴于其对人类公共卫生安全构成的威胁,加快类鼻疽的研究具有重要的实际意义。试验一利用革兰氏染色和16s rRA基因特异性检测等方法对本实验室保存的B.pseudomallei(BPHNl)菌株进行初步鉴定;通过B.pseudomallei OD600nm 的测定与平板计数相结合,建立了B.pseudomalle 菌数与OD值间的线性回归方程:y=4E+08x+5E+06(R2=0.9836)(0≤OD600nm≤l.2)。在不同感染复数(MOI)的条件下,感染RAW264.7细胞。通过分析B.pseudomallei对RAW264.7细胞的侵袭率和宿主细胞的形态变化特点,成功构建B.pseudomallei感染RAW264.7细胞模型。试验二是在B.pseudomallei感染RAW264.7细胞模型的基础上,以RAW264.7细胞为对照组,提取感染4h,8h,llh的细胞总RNA,进行RNA-seq测序。应用生物信息学方法,分析不同时间点差异基因的表达变化。结果表明,RAW-vs-Infect4、RAW-vs-Infect8 和 RAW-vs-Infect11 组分别具有 3383、1174 和 2583 个差异表达基因,且表达下调的基因数目多于表达上调的基因数目。此外,对不同时间点的差异基因进行模式聚类、GO功能注释和KEGG富集性分析。结果发现,在B.pseudomallei感染RAW264.7细胞过程中,获得26种差异基因动态表达模式,其中有7种为显著性富集。21.3%(1597/7510)的差异基因能够被注释到288条代谢或信号通路,其中85条显著富集(P<0.05)。与免疫炎症相关的趋化因子信号转导通路、TNF信号通路、p53信号通路等富集程度较强。选取与免疫相关的17个差异基因进行qRT-PCR验证,结果与RNA-seq的趋势变化一致,且两者相关性较强(R2=0.9306)。其中,CCL9、Ifnb1、TNF-a、Ptgs2、TNF-aip3、Zbp1、CCL5、Ifi202b、NFfkbia、Nfkbie、MlKl、IRF7 和P21基因的mRNA水平表达上调,而E2F2、TFDP1、PLK1和兄4D51基因的mRNA水平表达下调。本研究利用RNA-seq测序技术,分析B.pseudomallei感染RAW264.7细胞过程中,不同感染时间的mRNA水平的变化。从分子水平上揭示了B.pseudomalle 感染RAW264.7细胞过程中的代谢通路和分子调控网络,为类鼻疽临床治疗提供了新的依据。