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脊髓性肌萎缩症是一种常染色体隐性遗传性神经变性疾病，其特征是脊髓前角的α运动神经元变性，临床表现为肢体近端肌无力和肌萎。SMN基因是SMA的致病基因，该基因有两个结构基本相同的拷贝，分别称SMN1和SMN2，SMN1编码全长SMN(fl-SMN)蛋白，SMN2编码△7-SMN蛋白。研究表明，SMN1基因的功能缺陷是大多数SMA患者的发病原因，且SMA临床表型的严重程度与全长SMN蛋白的含量密切相关。我们设想，fl-SMN蛋白与脊髓前角的α运动神经元的凋亡调控相关，fl-SMN蛋白含量下降可能诱导α运动神经元凋亡，进而出现细胞的变性。本研究拟利用RNAi技术抑制非SMA患者的骨髓问质干细胞SMN1基因的表达，将其诱导分化为神经元样细胞建立SMA细胞模型，并通过一系列分子生物学方法观测其凋亡情况，以探讨SMN蛋白对神经元的保护作用及其机制。第一章RNA干扰对人骨髓间充质干细胞SMN1，基因表达抑制的实验研究目的：构建能在哺乳动物细胞中表达SMN1 shRNA的质粒，并初步探讨其对人骨髓间充质干细胞SMN1 mRNA及蛋白的抑制作用。方法：取非SMA病人(且无血液疾病及骨肿瘤)骨髓，分离、纯化得到骨髓间充质干细胞(MSCs)。根据Genbank中SMNl eDNA序列设计5条SMN1靶向的shRNA并克隆得到相应的DNA序列；将此DNA序列克隆至pRNAT-U6.1／Neo载体中U6启动子的下游，形成能在细胞内表达SMN1特异性的短发夹状RNA的重组质粒pshRNA-SMN1；在脂质体介导下将重组质粒pshRNA-SMN1转染人骨髓间充质干细胞，通过RT-PCR、Western-Blot、流式细胞分析技术检测转染后MSCs的fl-SMNmRNA及SMN全长蛋白的表达。结果：琼脂糖凝胶电泳及测序证实了重组质粒pshRNA-SMN1构建成功，转染后不同程度地抑制人骨髓间充质干细胞的fl-SMNmRNA及其蛋白的表达，其中以pshRNA-SMN1-1组和pshRNA-SMN1-4组最明显，mRNA水平上干扰效率分别为64.87％、61.45％，蛋白水平上干扰效率分别为60.25％和54.05％，流式细胞分析显示干扰效率分别为96.00％、94.29％，三项与对照组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论：构建的pshRNA-SMN1-1和pshRNA-SMN1-4重组质粒能有效地抑制人骨髓间充质干细胞f1-SMN mRNA及其蛋白的表达。第二章SMA细胞模型的建立目的：应用RNAi沉默SMN1基因的MSCs建立SMA细胞模型。方法：根据实验一的RT-PCR、Western-Blot分析结果，选择能在最大程度上抑制SMN1基因表达的重组质粒pshRNA-SMN1-1，将此重组质粒转染人骨髓问充质干细胞，经G418筛选得到能稳定表达目的shRNA的单克隆细胞系后并诱导其分化为神经元样细胞。后者通过细胞形态学观察及免疫细胞化学染色分析神经元样细胞NSE、NF蛋白表达进行鉴定。再次用RT-PCR，Western-Blot方法检测神经元样细胞SMN mRNA及其蛋白的表达，并与诱导前进行比较。结果：诱导后的细胞呈典型的神经元样细胞形态，免疫细胞化学染色显示细胞膜NSE、NF蛋白表达阳性；其fl-SMNmRNA、△7-SMNmRNA及fl-SMN蛋白表达均较诱导前增加(P＜0.05)，但PshRNA-SMN-1组的fl-SMN mRNA及蛋白表达仍明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；而诱导后△7-SMN mRNA的表达在各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：SMNI mRNA及其蛋白被抑制的MSCs诱导分化为神经元样细胞后可以作为SMA的细胞模型。第三章SMA模型细胞自发性凋亡与SMN蛋白的保护作用及其机制的研究目的：初步研究SMA模型细胞的自发性凋亡和丙戊酸对其凋亡的影响及其机制，以探讨SMN蛋白对神经元的保护作用及其机制。方法：实验以SMA模型细胞、正常神经元样细胞为研究对象，以1μmol／ml丙戊酸干预，共分为无干预正常神经元样细胞组、无干预SMA模型细胞组、丙戊酸干预正常神经元样细胞组、丙戊酸干预SMA模型细胞组等4个实验组，①绘制细胞生长曲线，观察各组细胞增殖趋势及速度；②采用噻唑兰比色实验(MTT)检测各实验组细胞的细胞活力变化；③Tunel荧光染色比较各实验组凋亡细胞比率；④流式细胞分析Annexin V法检测各实验组细胞凋亡及坏死情况；⑤RT-PCR检测各实验组细胞Caspase-3 mRNA的表达；⑥以不同剂量的丙戊酸分别对SMA模型细胞进行干预，RT-PCR检测各实验组细胞fl-SMNmRNA及Caspase-3 mRNA的表达；⑦Western-Blot检测各实验组细胞fl-SMN蛋白及Caspase-3蛋白的表达；⑧共聚焦显微镜共定位fl-SMN蛋白和Caspase-3蛋白。结果：①细胞生长曲线结果显示，各组细胞数均出现2次负增殖趋势：在第2次细胞负增殖期内(在诱导结束后第4、5、6天时)，不同时间点的细胞数目有统计学差异(时间主效应：P＜0.05)；且SMA模型细胞负增殖较正常神经元样细胞明显，两者之间差异有统计学意义(RNA干扰主效应：P＜0.05)；而丙戊酸干预后负增殖减小，与无干预组相比差异有统计学意义(丙戊酸主效应：P＜0.05)；②MTT结果显示，各组MTT曲线均出现2次细胞活力下降趋势；在第二次细胞活力下降期，各组细胞在诱导结束后第3、4、5、6、7天时的MTT值比较差异均有统计学差异(时间主效应：P＜0.05)，且SMA模型细胞的活力明显低于正常神经元样细胞(RNA干扰主效应：P＜0.05)，但丙戊酸干预与否差异无统计学意义(丙戊酸主效应：P＞0.05)；③Tunel荧光染色显示，SMA模型细胞组的凋亡细胞率为(40.824±3.66)％，明显高于正常神经元样细胞(22.98±2.04)(P＜0.05)：在丙戊酸干预后细胞凋亡率降低(31.69±2.53)％，而正常对照组却有增加(26.62±2.62)％：各实验组之间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)；④流式细胞分析Annexin V结果亦显示，SMA模型细胞组的细胞凋亡率(41.39％)较正常神经元样细胞组(32.93％)高，丙戊酸干预后细胞凋亡率减少(36.88％)，但正常对照组有增加(34.67％)：⑤RT-PCR凝胶电泳半定量结果表明，SMA模型组细胞Caspase-3 mRNA的表达量(0.85583±0.05241)明显高于正常对照组(0.14975±0.03093)(P＜0.05)，丙戊酸干预后表达量降低(0.61311±0.05093)(P＜0.05)，但正常神经元样细胞的Caspase-3 mRNA表达量升高(0.21796±0.03354)(P＜0.05)；⑥随着VPA的干预浓度增加，SMA模型细胞的fl-SMN mRNA及蛋白的表达增加，两者呈S形量一效相关(R=0.9424，P=2.047e-31；R-0.9424，P=5.682e-30)：而Caspase-3mRNA及蛋白的表达在VPA的干预浓度由1μmol／ml加至5μmol／ml时，是逐渐降低，两者呈S形量-效相关(R=0.959，P=4.510e-21；R=0.942，P=8.651e-19)，继续加大VPA的干预浓度，Caspase-3 mRNA的表达又逐渐回升，曲线成钩状；⑦共聚焦显微镜结果显示，fl-SMN蛋白和Caspase-3蛋白并无直接的相互作用。结论：①SMA细胞模型易发生凋亡，其可能与细胞内fl-SMN蛋白表达减少和Caspase-3蛋白表达增多有关。②一定剂量范围内的丙戊酸增加fl-SMN蛋白和减少Caspase-3蛋白表达后能减少SMA细胞模型的凋亡，提示SMN蛋白有神经元保护作用，但其与Caspase-3蛋白者间可能不是直接作用的结果。