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目的:张力是影响皮肤创面愈合的重要因素。皮肤缺损越大的创面存在越大的机械张力,高张力常常引起创面愈合延迟,最终导致病理性瘢痕的形成。皮肤成纤维细胞的增殖、迁移和分化被认为是创面愈合过程中的关键因素,调控成纤维细胞的生物学特性可能是促进创面愈合的有效手段。我们前期研究证实高幅度牵张力会刺激成纤维细胞增殖与分化,诱导肌成纤维细胞形成。局部应用间充质干细胞(MSCs)能够促进创面愈合,但是存在潜在的致癌风险。近年来,干细胞的应用理念已经延伸到利用干细胞的外泌体影响其它细胞的功能,调控机体微环境。目前,脂肪间充质干细胞外泌体(ADMSCs-exos)对张力性创面愈合的作用尚不完全清楚。本研究通过探索ADMSCs-exos促进张力性创面愈合的作用机制,为提升张力性创面修复效率和预防增生性瘢痕提供理论依据,为临床治疗张力性创面提供新思路。方法:1.从健康人的皮肤和脂肪组织中分离出正常的皮肤成纤维细胞和脂肪间充质干细胞。采用梯度超速离心法从人脂肪间充质干细胞中提取外泌体(Exosomes),BCA法检测外泌体浓度,并通过透射电镜观察外泌体粒子形态特征,应用粒度仪检测外泌体的直径分布,利用蛋白免疫印迹技术(Western-blot)检测外泌体特征性蛋白表面标志物来鉴定外泌体,为后续研究提供基础。2.在体外细胞实验中,通过利用不同浓度(0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml及100ug/ml)的外泌体处理正常皮肤成纤维细胞(NSFB)后,利用CCK-8法和细胞划痕实验分别检测外泌体对成纤维细胞的增殖与迁移的影响。采用Western blot和荧光定量PCR(qPCR)技术检测外泌体对成纤维细胞的I型胶原(Col–I)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白和mRNA表达的影响。Western-blot检测Wnt2b和β-catenin的蛋白表达情况。3.构建SD大鼠全层张力性皮肤缺损模型,即通过缝合橡胶圈的方式给创面施加一定张力,来建立张力性皮肤缺损模型。将大鼠随机分为Exo组、PBS组和空白对照组,通过局部注射的方式分别给予终体积量为200ul的100ug外泌体悬液和PBS缓冲液,空白对照组注射处理。分别于0d、3d、7d和14天时观察创面愈合状态,并拍照记录分析。在第14天处死大鼠,于创面或瘢痕组织的边缘2mm处切取标本,行免疫组化染色(Immunohistochemical staining,IHC)检测Col-I、Col-Ⅲ、α-SMA、Wnt2b和β-catenin的蛋白表达。结果:1.电镜下观察ADMSCs-exos的形态为杯口状,有双侧膜结构。BCA法测得每320ml细胞培养上清液所获得的外泌体浓度约为1.0mg/ml,粒子直径分布于40-100nm之间。Western-blot法检测到外泌体表面特异性蛋白标志物CD9和CD63。2.CCK-8结果显示,在ADMSCs-exos作用24h和48h后,成纤维细胞的增殖能力明显提高,且随着ADMSCs-exos浓度的增加而升高,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果显示,成纤维细胞的迁移速率随着外泌体浓度的增加而增高,在24h和48h时,Exos组和空白组残余划痕面积差异有统计学意义(P<0.05)。3.动物实验发现,第7d和14d时,Exo注射组的残余创面面积明显低于PBS组和对照组,愈合速率显著增快,差异有统计学意义(P<0.05)。4.Western-blot法和qPCR法检测结果显示,在ADMSCs-exos作用下的成纤维细胞的Col-I和Col-Ⅲ的蛋白和mRNA表达明显增加,而α-SMA的表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠标本IHC结果显示,在Exos组的Col-I和Col-Ⅲ的胶原表达提高,而α-SMA的表达明显降低(P<0.05)。5.Western-blot法检测结果示,ADMSCs-exos作用后,Wnt2b和β-catenin蛋白表达较PBS组和空白对照组明显增高。SD大鼠标本IHC结果出现类似的结果,Wnt2b和β-catenin蛋白表达在外泌体作用下明显增高(P<0.05)。结论:1.通过梯度超速离心法成功获得人脂肪间充质干细胞源性外泌体(ADMSCs-exos),并成功鉴定。2.ADMSCs-exos能促进成纤维细胞的生物学活性,表现在细胞增殖、迁移和胶原表达的提高。3.ADMSCs-exos能够激活Wnt/β-catenin信号通路,促进张力性创面愈合,预防病理性瘢痕形成。