香蕉NHX和SOS1基因鉴定及功能验证

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香蕉(Musa spp.)是世界上最受欢迎的水果之一,土地盐碱化严重影响了香蕉产业的可持续发展。NHX和SOS1等Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐机制中发挥着重要的作用。香蕉NHX和SOS1基因鉴定及功能分析未见报道。本研究采用不同基因型的巴西蕉(M.acuminata L.AAA group)和粉蕉(M.ABB group,Pisang Awak)幼苗(株高10~12 cm,生长条件一致)为试材;从香蕉A基因组数据库和B基因组数据库分别鉴定获取NHX和SOS1基因和蛋白序列;对MaNHXs、MbNHXs、MaSOS1、MbSOS1进行基因结构、顺式作用元件、跨膜结构、蛋白功能分析等生物信息学分析;采用qRT-PCR检测200 mmol·L-1 NaCl处理下香蕉幼苗NHX和SOS1基因的表达量;克隆MaNHX5、MaSOS1、MbSOS1基因,进行亚细胞定位、定点突变和转基因酵母功能验证,探究不同基因组Na+/H+逆转运蛋白的功能差异。研究结果如下:(1)从香蕉A基因组数据库鉴定到11个MaNHX基因家族成员,理化性质分析发现大部分MaNHXs蛋白等电点(5.86-8.88)大于8,蛋白质分子质量为57-62 k Da,亚细胞定位分析表明MaNHXs均定位在液泡。与拟南芥、水稻的NHX蛋白一起构建的系统进化树共分为2个聚类组,大部分香蕉NHX基因与拟南芥和水稻有较远的亲缘关系。大部分MaNHXs基因外显子(14-22)为14个,MaNHX10含有22个外显子。从香蕉B基因组数据库鉴定到9个MbNHXs基因家族成员,理化性质发现大部分MbNHXs蛋白等电点(6.01-8.69)大于8,蛋白质分子质量为50–171 k Da,亚细胞定位分析表明MbNHXs定位在液泡、细胞膜。与香蕉A基因组、拟南芥、水稻的NHX蛋白一起构建的系统进化树共分为2个聚类组。MbNHXs基因外显子为11~19个,MbNHX1含有19个外显子。(2)从香蕉A基因组数据库和B基因组数据库各获得1个香蕉质膜Na+/H+逆转运蛋白基因,命名为MaSOS1(Ma08_t18780.1)和MbSOS1(Mb08_t18680.1)。生物信息学分析表明,两个蛋白均具有PF00999保守结构域;MaSOS1和MbSOS1分别含有5种(Me JA、GA、SA、IAA、ABA)和4种(GA、IAA、ABA、Me JA)植物激素响应元件;MaSOS1和MbSOS1蛋白均含有12个跨膜结构;MaSOS1蛋白由1143 aa氨基酸编码,MbSOS1蛋白由964 aa氨基酸编码且在530~630 aa和670~710aa处有序列缺失;蛋白同源序列比对结果显示MaSOS1和MbSOS1蛋白均与油棕、海枣、菠萝、芦苇、莲、高粱同源蛋白亲缘关系最近。(3)qRT-PCR结果表明在200 mmol·L-1NaCl盐胁迫下,MaNHXs均在香蕉根、假茎和叶片中表达。处理3 h后,根中大部分MaNHXs上调表达,而处理12 h后MaNHXs表达量均下调,但处理24 h后表达量有所恢复。在假茎中,大多数MaNHXs分别在3 h、6 h、24 h上调表达,其中MaNHX3在24 h表达量上调3.42倍。在叶片中MaNHXs表达量均在12 h明显上调且MaNHX10表达量上调4.05倍;MaSOS1基因在根、假茎、叶片均受NaCl诱导表达,而MbSOS1基因主要在假茎中受NaCl诱导表达。(4)MaNHX5亚细胞定位实验表明,GFP信号与液泡膜Marker在液泡膜上有明显的共定位,表明MaNHX5蛋白主要在液泡膜上表达。MaSOS1亚细胞定位实验表明,MaSOS1蛋白主要在细胞膜上表达。(5)酵母互补实验表明,将MaNHX5基因的276位丝氨酸突变为天冬氨酸后,MaNHX5’-AXT3耐盐性强于MaNHX5-AXT3。MaSOS1基因和MbSOS1基因可以使酵母突变体AXT3的耐盐性和耐高温性显著提高。与只转入p416载体的AXT3突变酵母相比,结果显示:p416-AXT3酵母突变体在100 mmol·L-1 NaCl处理条件下生长受到明显抑制,MaSOS1-AXT3可在300 mmol·L-1 NaCl处理条件下正常生长,M b SOS1-AXT3可在500 mmol·L-1 NaCl处理条件下正常生长。AXT3酵母突变体在40℃条件下不能生长,而MaSOS1-AXT3在40℃高温条件下生长良好。2 mmol·L-1的CaCl2有利于MaSOS1-AXT3和MbSOS1-AXT3的生长,400 mmol·L-1 KCl、500 mm ol·L-1 KCl处理会抑制MbSOS1-AXT3的生长。
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