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水稻(Oryza sativa L.)是我国主要的粮食作物之一,也是一种在科学研究中常用的模式生物。常规的水稻遗传育种大大的限制了水稻功能基因组学的发展,而转基因技术的飞速发展与应用则对水稻的转基因育种产生了深远影响。到目前为止,成熟的水稻转基因技术仅仅应用于少数几种粳稻品种,如ZH11,日本晴等。对于目前一些具有转基因改良价值的籼稻品种,如93-11,其转基因效率却是十分低的。因而对一些重要的水稻品种进行组织培养能力和基因转化效率的探索成为目前水稻转基因技术研究的一个重要方向。而新一代的基因编辑技术CRISPR/Cas9,因其能够对植物基因组特定位点进行准确的定点编辑,为探索水稻胚性愈伤分化相关基因的研究工作提供了有力的工具。本研究主要通过两个方面对水稻胚性愈伤分化相关基因的研究工作进行了相关探索。一是通过对ZH11分化一段时间的愈伤进行转录组测序和i-TRAQ分析,筛选到一些可能和水稻胚性愈伤分化相关的基因。二是对一些可能和水稻胚性愈伤分化相关基因进行CRISPR/Cas9基因敲除。1.通过对水稻品种ZH11的分化时期的胚性愈伤提取RNA并做了转录组测序和i-TRAQ分析,找到了若干个和水稻胚性愈伤分化相关的基因,RicexPro网站上的基因编号分别为LOC_Os04g33240(TFT12),LOC_Os05g05930(TFT14),LOC_Os05g28210(EMP)。2.通过对TFT12和TFT14这两个基因的突变体材料和对应的野生型材料进行再生能力差异对比,发现在愈伤诱导水平上突变体材料和野生型材料之间并未有明显差异,但是在突变体材料的再生能力明显低于野生型材料。3.TFT12基因编码区全长为828bp,实时定量PCR分析TFT12主要在生殖生长的叶、根、内稃处高表达;TFT14基因编码区全长为582bp,实时定量PCR分析TFT14主要在胚以及胚乳处高表达;EMP基因编码区全长为288bp,实时定量PCR分析EMP主要在胚及胚乳高表达。4.EMP基因在野生型材料ZH11的水稻种胚萌发的48hr过程中,其表达量是逐渐上升的,但是在转基因材料EMPi在添加了诱导剂β-雌二醇的情况下萌发,该基因的表达量是先升高之后在下降。5.在EMPi材料种胚萌发过程中,转基因材料在添加了诱导剂β-雌二醇的情况下萌发率相对于野生型水稻的种胚的萌发率会出现一定程度的下降。6.EMP基因表达的蛋白质含95个氨基酸,蛋白质分子量约为10kDa,我们通过NCBI数据库找到了玉米、小麦、拟南芥等的同源蛋白序列,并构建了系统发育树。7.同样是基于转录组测序和i-TRAQ分析,找到了另外一些基因的表达量发生较为明显的变化,其中CKO1(LOC_Os01g09260)和Cht2(LOC_Os05g33130)表达量上调,而IAA20(LOC_Os06g07040)表达量下调。8.利用本实验室自主创建的简便、高效的多靶点编辑CRISPR/Cas9系统,分别对Cht2和IAA20这两个基因构建了单基因双靶点CRISPR/Cas9敲除载体,对基因CKO1构建了单靶点CRISPR/Cas9敲除载体。