传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性传染病。我国目前广泛采用中等毒力活疫苗防治IBD，但每年由IBD造成的经济损失巨大，超强毒株的出现更是对中国养禽业防治IBD构成了巨大威胁。使用毒力强的活疫苗，造成了更严重的法氏囊病理损伤和免疫抑制。如此长期大量的使用毒力不断增强的活疫苗，被认为是变异株和超强毒株出现的一个重要原因。　　 长期以来国内外学者一直都在尝试利用分子生物学和生物技术的方法研制IBD新型疫苗，近年来这些尝试和努力已经取得了可喜的研究进展。马立克病毒CVI988/Rispens疫苗株作为病毒活载体的安全性和有效性已经得到证实。本研究以CVI988/Rispens疫苗株为载体，在其基因组的复制完全非必需区US2插入IBDV-VP2抗原保护性基因，并在CMV启动子的控制下得以稳定表达，通过间接免疫荧光试验初步证实获得了无报告基因的表达IBDV-VP2蛋白重组马立克病毒CVI988/Rispens。　　 1马立克病毒CVI988/Rispens疫苗株通用转移载体pUC-VP2-US2的构建　　 通过PCR方法扩增出马立克病毒(CVI988/Respense株)基因组复制完全非必需片段US2区的左翼和右翼，分别命名为US2L和US2R。将US2L和US2R先后克隆入pUC18载体，阳性克隆命名为pUC-US2。然后将完整的法氏囊病毒VP2基因表达盒(包括CMV启动子，VP2 ORF以及PolyA信号)，以限制性内切酶XholⅠ和BglⅡ克隆入pUC-US2，获得不含任何报告基因的重组质粒pUC-VP2-US2。在脂质体介导下将该重组质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)。间接免疫荧光实验结果表明，该重组质粒可以在CEFs中表达法氏囊病毒VP2蛋白。这为下一步将该重组质粒转染感染马立克病毒的CEFs，获得表达法氏囊病毒VP2蛋白的重组马立克病毒奠定了基础。　　 2重组转移载体pUC-VP2-US2的瞬时表达及rMDV的初步检测　　 采用传统细胞计数法绘制了CEF的生长曲线，确定了转染CEF细胞的最佳时间。采用脂质体转染方法对转染时机、脂质体与质粒的体积质量比以及转染的细胞密度等进行了摸索。确定了重组转移载体最佳转染条件为在24孔细胞培养板上均匀铺满2×105细胞/孔，24小时后用Lipofectamine2000 reagent1.5μl和pUC-VP2-US2质粒1.0μg进行转染。最佳转染条件的确定增加了重组转移载体与马立克病毒发生细胞内同源重组产生重组马立克病毒的可能性。在此转染条件下对感染马立克病毒CVI988的CEF细胞转染重组质粒pUC-VP2-US2，通过细胞内同源重组。转然后4天将病毒空斑消化后，均匀感染两块96孔板。4天后通过用IBDV-VP2单克隆抗体185做间接免疫荧光实验，初步检测到了表达IBDV-VP2蛋白的重组马立克病毒阳性空斑，证明转移表达质粒构建正确。