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辅酶Q10(CoQ10)由醌环母核和长的聚异戊二烯疏水侧链组成,在自然界中分布广泛,在电子传递链中起传递电子的作用。辅酶Q10还能抗脂质过氧化,参与细胞能量代谢或进行基因表达调控。CoQ10生物合成途径主要由三个部分组成:MVA途径(Mevalonate pathway)/MEP 途径(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate pathway),莽草酸途径以及泛醌途径。CoQ10的原始生产菌株主要有放射型根癌农杆菌(Agrobacterium tumdfaciens),鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas.sp ZJUTE03)和类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。微生物发酵法生产CoQ10因其条件温和,环境友好,生产效率高等优点,成为当下研究热点。对羟基苯甲酸(pHBA)是CoQ10合成途径中醌环合成的重要前体物质,也是莽草酸途径的产物,直接影响了 CoQ10合成量。本课题分别从 Acinetobacter calcoaceticus,Klebsiella peneumoniae 和Corynebacterium glutamicum的基因组中成功克隆出目的基因Pcak,以实验室保藏的CoQ10原始生产菌Rhodobacter sphaeroides GY2为研究对象。构建含有来自Klebsiella peneumoniae 的 kp-pcak 基因,Acinetobacter calcoacetticus 的 ac-pcak 基因以及Corynebacterium glutamicum的cg-pcak基因的质粒,通过摄入外源添加的pHBA从而强化类球红细菌生产CoQ10。为了研究类球红细菌内源和外源pHBA的代谢途径,外源添加以同位素13COOH标记的pHBA从而可以检测菌体利用外源pHBA的情况。首先,以质粒pBBRl-MCS2为载体,构建包含pcak基因片段的质粒pBBR1-MCS2-tRFP-Pcak,利用接合转移的方法转化至类球红细菌中。其次,经过培养和发酵,提取细菌胞内CoQ10。结果表明在类球红细菌内克隆并表达Pcak基因,可强化重组菌从胞外直接摄取pHBA,进而增加类球红细菌胞内CoQ10的合成能力。HPLC测定结果表明,当添加0.25mM外源pHBA时,重组菌株RS-tRFP-KpPcak的CoQ10产率达18.06mg/g DCW,较原始菌株提高20.82%。接着,构建不含RFP的RS-KpPcak,RS-AcPcak以及RS-CgPcak共三个重组菌株,并进行5L罐的发酵,通过添加羧基上标记13C的外源pHBA,初步获得CoQ10粗样品并利用同位素示踪法鉴定13COOH-pHBA转化成CoQ1o的实际代谢过程。