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背景:小肠缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是临床常见的病理生理过程。小肠I/R损伤可原发于肠道及肠系膜血管病变,如小肠扭转、肠系膜上动脉栓塞等,也可继发于危及生命的临床症状,如重度烧伤、失血性休克和败血症等。小肠I/R使肠黏膜屏障破坏,细菌及内毒素迁移,可引发全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),严重者可导致多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。因而,促进小肠I/R损伤后肠黏膜屏障修复具有重要的临床意义。核受体相关因子1(nuclear receptor-related factor 1,Nurr1)属于核受体超家族成员。我们先前研究结果显示Nurr1在小肠I/R损伤后表达降低,与肠黏膜上皮细胞增殖有关。肠黏膜上皮细胞增殖、迁移、分化几个阶段相互协调控制肠黏膜屏障功能。研究表明,微小RNA(microRNA,miRNA)通过与Nurr1的3’端非编码区(3’UTR)结合形成基因沉默复合体从而调节多巴胺神经元的分化。最近研究发现miRNA通过与靶基因的3’UTR区结合,形成基因沉默复合体,从而调控小肠I/R损伤。因此,我们提出假说:Nurr1是小肠I/R损伤后肠黏膜屏障修复的关键分子,Nurr1在血流再灌注时期表达降低可能受miRNA调控,此miRNA通过靶向调控Nurr1的表达调节小肠I/R损伤后肠黏膜屏障修复,进而影响小肠I/R损伤。在本研究中,我们利用微阵列芯片和生物信息学数据库预测miR-381-3p与Nurr1存在靶向调控关系,对miR-381-3p及Nurr1进行干预,阐明miR-381-3p调控Nurr1通路在小肠I/R损伤后肠黏膜屏障修复中的重要作用,为小肠I/R损伤后肠黏膜屏障修复提供新的治疗靶点。目的:研究Nurr1对小肠I/R损伤后肠黏膜屏障修复的作用;探讨抑制miR-381-3p靶向上调Nurr1对小肠I/R损伤的保护作用和机制。方法:1.Nurr1对小肠I/R损伤后肠黏膜修复作用的研究将雄性C57小鼠随机分配为4组,每组8只鼠:假手术组(Sham)、假手术+C-DIM12组(Sham+C-DIM12)、模型组(I/R)、模型+C-DIM12组(I/R+C-DIM12)。小鼠术前4小时通过灌胃给予Nurr1激动剂C-DIM12,浓度为50mg/kg。假手术组小鼠麻醉后,打开腹腔分离肠系膜上动脉但不夹闭血管。模型组小鼠通过腹部正中切口打开腹腔,游离肠系膜上动脉并利用动脉夹将血管夹闭,夹闭时间为45min,松开动脉夹使恢复血流,时间为4h,取出小肠组织于-80℃超低温冰箱中保存以备实验使用。使用H&E染色法观察4组小鼠的小肠组织病理学改变;采用Western-blot法检测4组小鼠的小肠组织中occludin、ZO-1表达。2.miR-381-3p对小肠I/R损伤后肠黏膜修复作用的研究将雄性C57小鼠随机分配为4组,每组8只鼠:假手术组(Sham+LNA-NC)、假手术+LNA-381组(Sham+LNA-381)、模型组(I/R+LNA-NC)、模型+LNA-381组(I/R+LNA-381)。小鼠术前12小时通过尾静脉注射给予锁核酸修饰miR-381-3p抑制剂(LNA-381),浓度为2mg/kg。构建假手术组模型及小肠I/R模型。取出小肠组织于-80℃超低温冰箱中保存以备实验使用。使用H&E染色法观察4组小鼠的小肠组织病理学改变;采用Western-blot法检测4组小鼠的小肠组织中Nurr1、p21、occludin、ZO-1表达水平。3.miR-381-3p对肠上皮细胞H/R损伤后再生修复作用及相关机制研究(1)miR-381-3p对肠上皮细胞H/R损伤后再生修复作用利用Caco-2或IEC-6细胞构建体外缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型模拟小鼠体内小肠I/R损伤。以miR-381-3p抑制剂(ant-381)进行处理,分为如下4组:空白组(Control+ant-NC)、空白+ant-381组(Control+ant-381)、模型组(I/R+ant-NC)、模型+ant-381组(I/R+ant-381)。使用FITC-dextran通透率检测肠黏膜上皮细胞通透性,Western-blot法检测各组细胞Nurr1、p21、occludin、ZO-1表达水平。(2)miR-381-3p通过调节Nurr1对肠上皮细胞H/R损伤后再生修复作用及机制研究利用Caco-2或IEC-6细胞构建体外H/R模型模拟小鼠体内小肠I/R损伤。以miR-381-3p的抑制剂(ant-381)和Nurr1的抑制剂(siRNA-Nurr1,si-Nurr1)进行处理,分为如下5组:空白组(Control+ant-NC+si-control)、模型组(H/R+ant-NC+si-control)、模型+ant-381组(H/R+ant-381+si-control)、模型+si-Nurr1组(H/R+ant-NC+si-Nurr1)、模型+ant-381+si-Nurr1组(H/R+ant-381+si-Nurr1)。使用FITC-dextran通透率检测肠黏膜上皮细胞通透性,Western-blot法检测各组细胞Nurr1、p21、occludin、ZO-1表达水平。结果:1.与Sham组相比,I/R组发生明显的小肠病理学损伤;occludin、ZO-1表达降低。与I/R组相比,I/R+C-DIM12组小肠病理学损伤明显缓解,occludin和ZO-1表达升高。2.根据生物信息学数据库和微阵列芯片分析预测miR-381-3p靶向Nurr1 3’UTR区域。特异上调miR-381-3p可降低Nurr1的蛋白表达量,降低野生型Nurr1 3’UTR报告基因活性;特异下调miR-381-3p可上调Nurr1的蛋白表达量;miR-381-3p的表达改变不影响Nurr1 mRNA表达和突变型SIRT1 3’UTR报告基因活性。3.与Control+ant-NC组相比,H/R+ant-NC组细胞损伤加重,Nurr1、occludin、ZO-1表达降低,p21表达升高;与H/R+ant-NC组相比H/R+ant-381组细胞损伤明显改善,Nurr1、occludin、ZO-1表达升高,p21表达降低。4.与Sham+NC组相比,I/R+NC组出现显著的小肠病理学损伤,Nurr1、occludin、ZO-1表达降低,p21表达升高。与I/R+NC组相比,I/R+LNA-381组小肠病理学损伤明显缓解,Nurr1、occludin、ZO-1表达升高,p21表达降低。5.与H/R+ant-NC+si-control组相比,H/R+ant-381+si-control肠上皮细胞通透性显著降低;与H/R+ant-NC+si-Nurr1组相比,H/R+ant-381+si-Nurr1的肠上皮细胞通透性没有显著变化。与H/R+ant-NC+si-control组相比,H/R+ant-381+si-control组Nurr1、occludin、ZO-1表达升高,p21表达降低。与H/R+ant-NC+si-Nurr1组相比,H/R+ant-381+si-Nurr1组Nurr1、occludin、ZO-1和p21表达水平无明显变化。结论:1.Nurr1在小肠I/R损伤后的肠黏膜屏障修复过程中发挥重要作用。2.抑制miR-381-3p可上调Nurr1,进而改善小肠I/R损伤,具体表现为减轻肠黏膜上皮细胞通透性,减轻小肠病理学损伤,提高肠屏障蛋白表达水平。