普鲁兰酶（pullulanase,EC 3.2.1.41）,最早由Bender和Wallenfels在产气气杆菌（Aerobacter aerogenes）的培养过程中发现,因其能水解普鲁兰多糖而得名。它可以特异性水解普鲁兰多糖、淀粉及支链淀粉等分支多糖中的α-1,6-糖苷键。这一特性使得普鲁兰酶在淀粉水解相关的工业过程中发挥着非常重要的作用。其中,普鲁兰酶最主要的应用方式是用于淀粉的糖化过程,其工业应用条件为pH 4.5-5.5,温度55-65℃甚至更高,持续作用时间长达48-60 h。大多数已报道的I型普鲁兰酶无法适应这一工业条件,有些酶耐热性差,有些酶在pH 5.5或pH更小的条件下酶活很低,甚至会失活。即使是商业化的B.acidopullulyticus普鲁兰酶也存在明显短板,其在60℃时的半衰期仅有34.9 min,没有足够强的耐热性。为此,本研究以获得性能优良的普鲁兰酶为目标,结合已有普鲁兰酶的序列信息对NCBI数据库中潜在的普鲁兰酶序列进行挖掘。对挖掘到的三个潜在普鲁兰酶序列在大肠杆菌中进行了重组表达,重组酶经分离纯化后进行了酶学性质的测定。综合评价三个普鲁兰酶的酶学性质,选出性能最好的普鲁兰酶进行分子改造,进一步提高了其耐热性和催化效率。此外,为了避免文献中酶活测定时反应体系多种多样的情况给我们的实验结果带来影响,以及为了使实验过程中酶活的测定更加方便快捷,本研究还优化了普鲁兰酶的活性测定方法。（1）优化了普鲁兰酶酶活的测定方法。评价了3种DNS试剂、2种反应体积比和煮沸时间对酶活检测灵敏度、检出限和稳定性的影响。选择灵敏度和稳定性均较高的DNS-Ghose试剂用于后续实验;选择检出限低、灵敏度高的Mod方法用于后续实验;选择煮沸2 min进行显色,大大缩短实验时间。优化后的测定方法为:1%普鲁兰糖20μL+酶液20μL+DNS试剂60μL+去离子水100μL,选用DNS-Ghose试剂,煮沸时间不小于2 min。（2）挖掘到三个潜在普鲁兰酶序列,在大肠杆菌重组表达系统中成功表达。将已有普鲁兰酶序列作为模板,在NCBI数据库中进行blast分析,根据序列相似度选择了分析结果中的3个蛋白序列。对这3个蛋白序列进行了基本信息分析、进化树分析、同源性分析、保守区和特征位点分析,从序列分析结果判断,它们应该是I型普鲁兰酶。为了进一步通过酶学性质验证,对这3个蛋白序列构建了大肠杆菌表达系统并通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示IPTG添加终浓度为1 mM、诱导时间为6 h时,目的蛋白表达量较高,可以达到后续实验的要求。（3）获得了一个适用于淀粉糖化过程的普鲁兰酶。对3个普鲁兰酶蛋白进行了分离纯化,测定了纯化蛋白的pH对酶活的影响、温度对酶活的影响、pH稳定性、温度稳定性、金属离子和化学试剂对酶活的影响、反应动力学常数和不同底物的水解产物。对这3个酶的酶学性质进行比较,并详细讨论了它们与已报道普鲁兰酶相比存在的优势和劣势。这3个酶的最适pH都在工业应用范围内,其中PulF的耐热性最高而PulC的比酶活最高。PulF是目前最适pH符合工业要求的普鲁兰酶中耐热性最好的。（4）获得了一个耐热性和催化效率显著提高的普鲁兰酶突变体。PulF和商业化的B.acidopullulyticus普鲁兰酶相比,还存在比酶活不高这一短板。本研究基于序列比对和蛋白结构分析,选择了6个距离催化位点10埃以内的非保守氨基酸残基进行定点突变。测定了突变体的pH对酶活的影响、温度对酶活的影响、温度稳定性和反应动力学常数,6个突变体的耐热性均显著提高,其中V481C的催化效率也得到了大幅提高,其比酶活为野生型酶的将近2倍。