PROX1基因在肾癌中的表达及其对肾癌细胞生物学行为影响的实验研究

来源 :复旦大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:qianjun0412064
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目的意义:同源异型蛋白PROX1(prospero-related homeobox)是果蝇Prospero蛋白在脊椎动物中的同源物。人类PROX1基因在1996年被首次分离,位于人类染色体1q32.2-q32.3,基因组由5个外显子和4个内含子构成。PROX1基因的cDNA全长为2924bp,编码包含737个氨基酸的蛋白质,分子量为83kDa。近年研究证实,PROX1蛋白可调控细胞分化,在中枢神经系统、晶状体、视网膜、肝脏、胰腺及淋巴管等多种组织器官胚胎发育过程中发挥重要作用。同时,在人类多种肿瘤中检测到PROX1异常表达。一方面,在神经胶质瘤、结直肠癌、肝癌中PROX1呈高水平表达,且PROX1可增强细胞迁移能力而促进肿瘤转移;另一方面,在胰腺癌、乳腺癌、白血病等肿瘤中由于DNA甲基化作用引起PROX1表达下调,且PROX1表达水平与肿瘤细胞的分化程度呈正相关,PR OX1表达水平高的患者预后良好。正如在胚胎发育过程中PROX1作用的发挥具有组织特异性一样,在不同类型的肿瘤中,PROX1即可表现出促进肿瘤侵袭的作用亦可扮演抑制肿瘤进展的角色,表明PROX1在人类肿瘤发展中发挥重要作用。本研究的目的是确定PROX1基因在肾癌中的表达特征,探讨其在肾癌发生发展中所起的作用,并进一步探索潜在的分子机制,为肾癌的防治提供理论基础。实验方法:1、采用RT-qPCR、Western blot或免疫组织化学方法明确PROX1在人肾癌组织、癌旁肾组织、人肾癌细胞系及肾小管上皮细胞系中的表达情况。2、构建靶向PROX1的siRNA慢病毒表达载体及PROX1的慢病毒表达载体并进行慢病毒的包装以用于后续的细胞功能实验研究。3、用靶向PROX1的siRNA重组慢病毒感染经Western blot证实高表达PROX1的肾透明细胞癌细胞系ACHN,降低该细胞中PROX1的表达水平,同时用PROX1重组慢病毒感染经Western blot证实低表达PROX1的肾透明细胞癌细胞系786-0,提高该细胞中PROX1的表达水平,进而通过CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒分析细胞生长情况,平板克隆形成实验观察细胞克隆形成能力,划痕实验检测细胞迁移能力,并运用蛋白质免疫印迹技术检测细胞增殖迁移相关蛋白的变化。实验结果:1、通过RT-qPCR、Western blot或免疫组织化学方法检测了人肾癌组织、癌旁肾组织、人肾癌细胞系及肾小管上皮细胞系中PROX1 mRNA或蛋白质的表达。结果显示,92例新鲜手术切除标本中,肾癌组织PROX1 mRNA的表达水平较其对应的癌旁肾组织低(p<0.001),出乎意料的是,按照病理分期和Fuhrman分级分层后,T3/4和G3/4肿瘤组织PROX1 mRNA表达量较T1/2和G1/2肿瘤组织表达量有增高趋势,虽然差异无统计学意义;115例石蜡包埋标本中,89.7%的癌旁肾组织PROX1蛋白呈高水平表达,仅33.9%的肾癌组织高表达PROX1蛋白,与PROX1 mRNA表达特征相似,T3/4和G3/4肿瘤组织PROX1蛋白表达量分别高于T1/2和G1/2组织,且PROX1蛋白表达水平与肿瘤核分级(p<0.001)和肿瘤淋巴结转移(p=0.012)呈正相关,PROX1蛋白高表达患者生存时间较短,Cox风险比例模型显示,PROX1可以作为肾癌患者的独立预后因子;人肾小管上皮细胞HKC的PROX1蛋白表达水平较高,肾癌细胞系ACHN、769-P及OS-RC-2的PROX1蛋白表达水平较高,而786-0细胞几乎不表达PROX1蛋白。2、首先采用pLKO.1复制缺陷性慢病毒载体构建靶向PROX1的siRNA重组慢病毒包装质粒,然后采用内含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的pWPI慢病毒载体构建PROX1重组慢病毒包装质粒,继而通过脂质体转染法将重组慢病毒包装质粒与重组慢病毒包装辅助质粒共转染人胚肾细胞系293,经过滤后获得重组慢病毒悬液。3、通过Western blot证实,重组慢病毒vLKO.1-si259和 vLKO.1-sil646感染ACHN细胞后可显著敲低内源性PROX1的表达水平,CCK-8细胞增殖试验检测结果显示vLKO.1-si259口vLKO.1-si1646感染的ACHN细胞各检测时间点OD值均低于vLKO.1-siSCR感染的阴性对照组ACHN细胞,且随着时间的延长差异愈加明显,提示PROX1的表达对ACHN细胞生长具有促进作用;平板克隆形成实验显示vLK○.1-si259和vLKO.1-si1646感染的ACHN细胞克隆形成率(27.3%和21.3%)显著低于vLK○.1-siSCR感染的阴性对照组ACHN细胞(55%);划痕实验显示vLKO.1-si259和vLKO.1-si1646感染的ACHN细胞24小时平均迁移距离(537.6μm和533.9μm)短于vLKO.1-siSCR感染的对照组ACHN细胞(692.6 μm)。此外,重组慢病毒vWPI.1-PROX1感染786-0细胞后可显著增强其PROX1表达水平,与PROX1 RNAi实验结果相反,vWPI.1-PROX1感染的786-0细胞各检测时间点OD值、克隆形成率(45% vs32%)均高于野生型786-0细胞,其平均迁移距离(479.6 μm vs 326.9μm)也长于野生型786-0细胞。最后利用Western blot检测发现,vLKO.1-si259和vLKO.1-si1646感染的ACHN细胞中E-cadherin表达增强,Vimentin表达减弱,而vWPI.1-PROX1感染的786-○细胞中E-cadherin表达下调,Vimentin表达上调。实验结论:PROX1在癌旁肾组织中呈高水平表达,而在肾癌组织中表达水平降低;PROX1蛋白表达水平与肾癌分期、分级、淋巴结转移呈正相关,与患者预后呈负相关,可作为肾癌的独立预后因子;PROX1能够促进肾癌细胞生长、克隆形成,加速细胞迁移,并能下调E-cadherin的表达,上调Vimentin的表达。本研究从基因水平初步探讨了PROX1在肾癌发生发展过程中所起的作用,有助于人们进一步了解肾癌的分子发病机制,为肾癌的诊断与治疗提供新思路,为PROX1作为肿瘤基因治疗的靶点和抗癌药物的研究提供重要的实验依据。
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