光学纯扁桃酸及其衍生物是合成多种医药中间体的关键手性砌块,如(R)-扁桃酸是一种重要的精细化工中间体和手性药物前体,被广泛应用于制药及化工行业;腈水解酶是生物催化法制备(R)-扁桃酸的一种重要工业用酶,因其具有原料廉价和100%理论产率等优点,有很大的工业应用潜力。本论文将nitA的同源模型与底物扁桃腈进行分子对接,选取位于活性中心周围的两个残基位点(Thr132,Ser190)分别进行理性设计的定点突变。结果表明Ser190位残基是对腈水解酶活性和对映体选择性具有较大影响的关键位点,取代氨基酸残基的侧链大小显著影响腈水解酶的催化性能,当Ser190位丝氨酸被甘氨酸残基取代后显著增加其对扁桃腈的活性及对映体选择性,而被亮氨酸残基取代后几乎表现出无活性。最佳的突变体S190G,它催化扁桃腈的活力是出发菌株的3倍,且对映体选择性从94%提高到>99%。为了从生物化学角度阐明催化活性增加的原因,对nitA和突变体S190G催化扁桃腈及氯代扁桃腈的稳态动力学参数进行测定。突变体S190G的酶学性质研究显示:其最适温度和最适pH为50°C和pH 7.5。突变体S190G对扁桃腈具有最大的底物亲和力(K_m:0.76mM),它的催化效率是野生型nitA的7.5倍,同时它的对映体选择性(E)从145.12提高到>200,显示了很大的工业应用潜力。为了更好的理解nitA和突变体S190G催化底物活力及对映体选择性之间的不同,本文通过AutoDock4.0将突变前后的同源模型和底物扁桃腈(R-型和S-型)进行分子对接。同时,本文也分析了nitA和S190G催化隧道的变化。结果表明,Ser190位残基对催化中心的空间结构影响很大,突变体S190G的隧道半径及隧道体积为1.48和13?3,而出发菌株nitA分别为0.65和25.0?3,更大的催化隧道半径和更小的隧道体积能够提高腈水解酶储藏和选择性催化底物的能力。为了在实际应用中验证突变体S190G催化活性的提高,以100mM扁桃腈为底物进行催化水解反应。反应30分钟后突变体S190G的转化率达到100%,e.e._p大于99%,而野生型nitA的转化率只有60%,e.e._p为94%,S190G介导的水解扁桃腈反应速率达到200毫摩尔/升/小时,这在目前现有的腈水解酶针对(R)-扁桃酸生产中是最高的反应速率。为了解除底物抑制和提高(R)-扁桃酸的积累量,使用了甲苯-水两相体系(2:8,v/v),S190G在11.5 h内能最大催化1M扁桃腈转化生成841.24 mM产物,e.e._p大于99%,突变体S190G是应用合成(R)-扁桃酸方面十分具有潜力的生物催化剂。