论文部分内容阅读
产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5是本实验室从自然界筛选到的一株优良菌株，现已应用于甘油工业化生产。与其他酵母相比，具有诸多优势，如耐高渗透压、生长速度快、甘油产率高等，在生物合成3-羟基丙酸、1,3-丙二醇等重要化合物方面有广泛的应用前景，是基因工程领域潜在的优良宿主。而目前对该菌分子水平的研究较少，适用于该菌的转化载体非常缺乏，致使该工业菌株的应用潜力没有充分发挥，因此我们急需构建适用于该菌的转化载体，创建适用于该菌的的转化体系，为该酵母遗传学研究及分子水平改造提供基础。本文以构建适用于该工业菌株的转化体系为目标，主要结果如下：1.构建了适用于C. glycerinogenes的低分子量的穿梭型整合载体pUSGZ。该载体以pUC19质粒为基本骨架，C. glycerinogenes的18S rDNA为整合位点，利用其3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PCggpd启动外源基因表达，腐草霉素抗性基因ble作为重组酵母转化子筛选标记，添加外源基因插入位点(MCS)，以18S rDNA下游终止子终止转录，通过分子手段获得稳定的整合型表达载体。空载质粒pUSGZ经Hind III酶切线性化后电转化入C.glycerinogenes，筛选得到Zeocin抗性菌株，经PCR验证， pUSGZ成功整合到C.glycerinogenes18S rDNA位点。2.以绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因验证表达体系在C. glycerinogenes中的整合表达。在整合载体pUSGZ的多克隆位点MCS处插入报告基因gfp，线性化后将重组质粒电转化入C. glycerinogenes，获得重组酵母C. glycerinogenes-gfp；通过荧光显微镜能观察到该酵母发出稳定的绿色荧光，说明该载体实现了外源基因的整合表达。3.利用绿色荧光蛋白GFP的表达强度研究该体系受渗透压调控的表达效果并实现高渗表达。将重组酵母C. glycerinogenes-gfp置于不同浓度的葡萄糖、NaCl、KCl和山梨醇等渗透压调节剂条件下进行诱导表达。通过对荧光强度进行分析，结果表明：在菌体可生长范围内，荧光强度随着渗透压的升高而增强；不同的渗透压稳定剂诱导下，目的基因的表达效果也不同，其中葡萄糖及NaCl的诱导效果最好；在60%葡萄糖高渗条件下仍能过量表达，且荧光强度提高了8倍。这说明PCggpd在产甘油假丝酵母的代谢系统中受渗透压的调控，且该表达体系能启动外源基因在高渗条件下过量表达。4.利用半定量RT-PCR测定重组酵母绿色荧光蛋白基因在不同渗透压下的转录水平，来考察该表达载体的性能。重组产甘油假丝酵母置于含不同浓度葡萄糖、NaCl、KCl、山梨醇等渗透压调节剂中处理后，提取酵母总RNA，去DNA反转录后进行半定量测定。结果显示，不同条件下gfp转录水平与GFP表达效果基本相符。这为以PCggpd为启动子的整合型表达载体在实际中的应用奠定了坚实的理论基础。