阿尔茨海默病(Alzheimersdisease，AD)是一种以进行性的认知功能障碍、老年斑、神经纤维缠结及基底前脑胆碱能神经元丢失和突触丢失为特征的中枢神经系统退行性疾病。AD是老年性痴呆的主要原因之一，占总病因50％以上，严重影响老年人口的生存质量。AD的发病机制错综复杂，目前认为神经元的老化以及多种原因引起的神经元凋亡是其主要发病原因之一。因此，延缓脑神经元的老化、阻止神经元凋亡可能成为AD的有效防治策略。 端粒酶(Telomerase)因其与被誉为控制人类细胞衰老的有丝分裂钟——端粒(Telomere)的特殊关系，一直是衰老相关疾病以及肿瘤防治研究的热点。hTERT(humantelomerasereversetranscriptase)为人端粒酶催化亚基，是端粒酶发挥功能的必需组分。人体内有旺盛增殖能力的生殖细胞、造血干细胞等可检测到端粒酶活性，而多数增殖能力有限的体细胞不表达或仅低表达端粒酶活性。许多研究发现hTERT基因转染重建(激活)端粒酶活性可延缓细胞衰老甚至使细胞永生。虽85％以上的癌细胞具有很高的端粒酶活性，但端粒酶基因不是致癌基因，端粒酶的激活不是癌变的前提和必要条件。近来研究显示端粒酶和hTERT与神经元的生长、发育、衰老和凋亡有着密切的关系。 为了进一步阐明端粒酶和hTERT的神经元保护机制，本实验选择pADEasy-1腺病毒载体系统构建hTERT基因重组腺病毒。腺病毒载体转染效率高，宿主范围广，生物安全性较好，在包装细胞内易扩增得到高滴度病毒，而且既可感染增殖细胞又可感染非增殖细胞。构建hTERT基因重组腺病毒并鉴定其对原代培养神经元的感染力以及基因转移效果，可为后续的研究创造条件，为探索以端粒酶为靶点的AD基因治疗新途径奠定基础。本研究包括以下两个主要内容： 第一章hTERT重组腺病毒骨架载体(pAD-hTERT)的构建 目的构建hTERT重组腺病毒骨架载体(pAD-hTERT) 方法以质粒pCI-neo-hTERT为模板，设计引物，两端引入酶切位点，PCR法获取目的基因；将目的基因定向克隆到pADTrack-CMV穿梭质粒得到重组穿梭质粒pADTrack-hTERT并酶切及测序鉴定；Pme-1线性化的重组穿梭质粒和空穿梭质粒分别与腺病毒骨架pADEasy-1在BJ5183菌进行同源重组，得到hTERT重组腺病毒骨架质粒pAD-hTERT和对照GFP腺病毒骨架质粒pAD-GFP，酶切鉴定。将鉴定正确的pAD-hTERT和pAD-GFP转化DH5α冻存备用。 结果酶切及测序分析重组穿梭质粒构建正确，目的基因未突变；酶切分析证实重组穿梭质粒和空穿梭质粒与pADEasy-1正确同源重组，hTERT重组腺病毒骨架质粒带有目的基因。 第二章hTERT重组腺病毒(AD-hTERT)的包装、扩增与鉴定 目的包装、鉴定hTERT重组腺病毒，并扩增获得高滴度腺病毒。 方法PacⅠ酶切线性化pAD-hTERT和pAD-GFP腺病毒骨架质粒，纯化灭菌；利用FuGENE6TransfectionReagent将两种病毒骨架质粒转染HEK293细胞；荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，收集病毒上清，PCR法鉴定目的基因；病毒上清重复感染HEK293获得高滴度重组腺病毒；测定重组腺病毒感染复数(MultiplicityofInfection，MOI)；感染人胚胎海马原代培养神经元；RT-PCR法分析目的基因的表达。 结果PCR结果说明重组腺病毒携带目的基因；报告基因GFP的表达显示重组腺病毒具有感染活力；RT-PCR结果显示重组腺病毒感染人胚胎海马原代培养神经元后有目的基因mRNA的表达。 结论 1成功构建两种重组腺病毒骨架质粒pAD-hTERT和pAD-GFP。 2成功构建两种重组腺病毒AD-hTERT和AD-GFP。 3重组腺病毒具有较好感染力，能感染原代培养神经元并检测到目的基因的表达，为后续的探讨端粒酶的神经保护功能和机制提供了条件，为探索以端粒酶为靶的AD基因治疗策略奠定了基础。