上皮性卵巢恶性肿瘤(Ovarian malignant epithelial tumors),致死率多年来一直居妇科恶性肿瘤之首,五年生存率始终徘徊在30%-40%。目前卵巢癌治疗的标准方案是在肿瘤细胞减灭术的基础上施以铂类药物为主的联合化疗。随着生活水平的提高及生活环境污染加剧,卵巢癌的发病率出现年轻化趋势,虽然多数卵巢癌患者发生在绝经后,但依然有40%左右的生育期患者因手术治疗而导致人工绝经,这些年轻的生育期患者术后所面临低雌激素引起的绝经症状要比自然绝经的妇女更为强烈,使患者在术后有限的生存期内生活质量严重下降,进一步促进了卵巢恶性肿瘤非癌症死亡率。虽然,目前已有的临床试验性治疗的结果显示,17β-雌二醇作为性激素药物应用于绝经期综合症可获得良好的临床效果,但其在卵巢癌术后激素替代治疗的安全性作用机制尚不明确。2013年美国妇产科医师协会ACOG和中华医学会妇产科学分会绝经学组制定的指南中均指出HRT是维持围绝经期和绝经后妇女健康策略的重要组成部分之一;人工绝经者由于雌激素缺乏时间更长,HRT具有更多益处[13],MWS研究认为激素补充治疗时卵巢癌的风险也会增加。故而是否可将17β-雌二醇作为辅助药物常规运用于生育期卵巢癌术后患者的临床治疗目前还没有达成共识。近年来研究发现,FOXM1转录因子存在于多种组织中,并且在多种肿瘤组织和细胞系中高表达,包括卵巢癌。Fox M1转录因子在上皮性卵巢癌的发生、发展中起到了重要作用,有文献显示Fox M1与ERα受体通路密切相关,FOXM1与雌激素结合可能和卵巢肿瘤有关,有望成为卵巢癌基因治疗新的靶点。目的:本实验致力于研究雌激素对Fox M1高表达与ERα不同表达的卵巢癌细胞系的增殖生长作用的影响,并对可能机制进行初步的探讨。首先运用了Western blot检测方法检测了卵巢癌细胞株A2780,SKOV3中ERα、FOXM1的表达情况,为进一步探讨ERα、FOXM1以及FOXM1阻断剂硫链丝菌素在卵巢癌细胞株A2780,SKOV3体外生长中的作用及相关机制筛选出良好的细胞模型。尝试探索17β-雌二醇体外诱导卵巢癌细胞生长可能存在的机制,为卵巢癌术后激素替代治疗的安全性提供理论依据。方法:用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、0.01%青霉素、链霉素以及25m M HEPES的RPMI1640培养液,在37℃,含饱和湿度5%C02的恒温培养箱中常规培养人卵巢癌细胞株A2780,以及人卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3度,每日在倒置显微镜下观察细胞密度以及细胞生长情况,每隔两天换液一次,约每周需传代一次,选取对数生长期的细胞进行实验。各种操作均需在超净台中操作完成。1倒置显微镜:应用倒置显微镜观察A2780细胞以及SKOV3细胞的形态并拍照。2四甲基偶氮甲唑蓝(MTS)法:对卵巢癌细胞系(SKOV3、A2780)进行了不同浓度梯度(10-5M、10-7M、10-9M、10-10M、10-12M和10-14M、10-16M)的雌二醇作用不同时间(24h、48h、72h),以不加17β-雌二醇药物含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基为空白对照组,以含有低于0.1%酒精浓度含有的10%胎牛血清的RPMI1640培养基作为溶剂对照组。MTS法检测17β-雌二醇对细胞生长的影响,筛选出药物作用的最适浓度以及时间。3蛋白印迹法(Western blot)法:检测A2780以及SKOV3细胞株中ER、FOXM1蛋白的表达水平以及不同浓度梯度的17β-雌二醇作用不同时间以后对A2780以及SKOV3细胞株中ER、FOXM1蛋白的表达水平影响情况。4创伤愈合实验:常规培养A2780细胞以及SKOV3细胞使其融合形成单细胞层。用不含胎牛血清、无酚红的RPMI1640培养基饥饿细胞24h使其同步化后,按照实验组给予不同干预,在6孔培养板底部中央区域呈“一”字形划痕,分别于给药后0h、24h后在倒置显微镜(40X)下观察照相,计算24h内划痕愈合的面积评估细胞的迁移能力。5 Transwell实验:以10-10M、10-12M、10-14M的17β-雌二醇作用于SKOV3和A2780细胞,含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基为空白对照组。连续培养24h以后取出Transwell小室,使用95%的乙醇固定,用结晶紫染色,在倒置显微镜(200X)下计算移动到Transwell小室微孔膜下层的细胞并评估迁移与侵袭能力细胞数量及拍照。结果:1人卵巢癌细胞株A2780细胞及SKOV3细胞:倒置显微镜观察卵巢癌细胞A2780、SKOV3生长状态良好,A2780细胞形态为多角形透明,细胞铺盖良好,细胞椭圆形、圆形,细胞间连接紧密,SKOV3细胞呈现铺路石状排列,伴随时间的推移,细胞接触紧密,并且数量开始增加,为典型上皮样细胞形态。2 Western blot检测ERα在A2780中呈阴性表达(无表达),SKOV3细胞株中ERa呈阳性表达,FOXM1在A2780、SKOV3细胞中均有表达。给予雌激素分别作用于A2780细胞与SKOV3细胞48h、72h,两种细胞内FOXM1表达量随着时间的延长而随之增加。3 MTS检测17β-雌二醇作用于各组细胞24h、48h、72h后增殖能力,结果发现,与对照组相比,A2780细胞株随着时间延长与剂量浓度增加呈现增殖能力递增现象。而在给予17β-雌二醇基础上24h后加入FOXM1阻断剂阻断剂硫链丝菌素共同培养48h以后与对照组相比呈现增殖下降趋势。SKOV3细胞株随着时间延长与剂量浓度增加呈现一个增殖下降趋势,使用高浓度或者给予低浓度17β-雌二醇以及FOXM1阻断剂硫链丝菌素对SKOV3细胞株处理后表达对增殖无影响。17β-雌二醇浓度为10-5M、10-10M、10-12M、10-14M药物作用时间为12~24h时,SKOV3细胞对药物最为敏感,10-10M抑制细胞增殖的作用最强;再加大药物浓度或延长药物作用时间不能明显提高细胞的凋亡率。4划痕实验及Transwell小室检测肿瘤细胞迁移能力:结果发现,与对照组相比,10-10M浓度E2作用于A2780细胞24h以后观察结果显示,给予17β-雌二醇刺激组划痕愈合面积显著小于对照组(49.32±3.12 VS 9.62)(P<0.01);Transwell实验结果显示处理组穿膜细胞个数明显多于对照组(36±5 VS 16±3),差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:在A2780细胞中FOXM1可能介导了雌激素依赖的增殖作用。随着雌激素浓度梯度增加对A2780细胞的的增殖作用呈浓度时间依赖性,增殖作用主要取决于17β-雌二醇的浓度和作用时间,随着17β-雌二醇浓度增加和作用时间的延长,A2780细胞的增长率明显升高。在SKOV3细胞中17β-雌二醇具有抑制细胞生长作用,抑制生长率随着17β-雌二醇浓度增加和作用时间的延长而明显。差异均有统计学意义(均P<0.01)。FOXM1的增殖作用可能不是通过ERα受体通路的介导。但是,FOXM1介导了17β-雌二醇刺激时A2780、SKOV3细胞的增殖;但FOXM1这一作用可以被FOXM1特异性阻断剂硫链丝菌素所阻断,因此,FOXM1可以促进激素补充治疗时对卵巢癌细胞的增殖,但是其功能作用取决于细胞的种类和特征,不同浓度雌激素对细胞的增殖作用不同,呈剂量时间依赖性,E2在ERα受体阳性的SKOV3卵巢癌细胞中安全性要比ERα阴性的A2780细胞中安全性更优。