水稻木聚糖乙酰化机理研究

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细胞壁是植物细胞的特征结构,在植物生长发育中发挥至关重要的作用。而细胞壁乙酰化作为一种细胞壁主要的修饰形式,其修饰水平和位置对细胞壁的理化性质、多聚物间的互作、进而对细胞壁结构均具有重要影响。与其重要性相比,细胞壁多糖乙酰化修饰机制以及生物学功能仍不清楚。研究表明,在模式植物拟南芥中有三类基因家族参与了细胞壁多糖的乙酰化修饰,分别是RWA(ReducedWall Acetylation)、TBL(Trichome Birefrigence-Like)家族和AXY9(Alteredxyloglucan9)基因家族,但功能揭示的基因仍相当有限。水稻作为一种单子叶模式植物以及重要的农作物,细胞壁多糖乙酰化机制的研究基本为空白。  木聚糖是水稻次生壁中最主要的半纤维素。研究发现它的主链和侧链上均存在大量的乙酰化修饰,而木聚糖主链的乙酰化修饰存在于所有的植物中。因此,解析木聚糖乙酰化修饰机理成为本领域的热点。  本研究围绕上述问题,通过对水稻中TBL基因家族的生物信息学和表达分析,发现水稻中存在66个TBL家族成员。我们遴选到8个可能参与木聚糖乙酰化的TBL候选基因。针对这些候选基因,我们利用遗传学手段筛选和创制了相应的突变体和转基因材料。在此基础上,我们利用ostbl1和ostbl2突变体,对这两个TBL蛋白开展了深入的功能研究。对ostbl1、ostbl2、tbl1 tbl2等突变体和相关转基因材料进行表型观察和细胞壁成分分析,发现突变体均表现矮生;化学和二维核磁共振分析发现细胞壁、尤其是木聚糖中乙酰基含量降低,其中双突变体表型较为严重。通过序列比对发现,这两个TBL蛋白序列相同度达97%。而基因表达和Western blot等分析证明OsTBL1为主效基因。随后,本研究主要围绕OsTBL1开展了一系列生化方面的研究,证明了OsTBL1定位于高尔基体。而重组表达缺失跨膜域的OsTBL1蛋白能够将乙酰基转移到木聚糖和木寡糖上,且这种活性符合饱和动力学特征。同时我们还证明OsTBL1最适底物是寡聚木五糖;二级质谱分析酶活产物表明,OsTBL1可以将乙酰基转移到两个连续的木糖残基上,而这种活性在拟南芥TBL中尚未发现。进一步,我们利用二维核磁共振实验证实OsTBL1能够催化木糖残基2-O位和3-O位的单乙酰化反应,而且该酶活得到了相关遗传材料证实。因此,我们通过遗传和生化证据证明OsTBL1和OsTBL2是木聚糖单乙酰化转移酶。此外我们还发现,突变体ostbl1和tbl1tbl2对水稻白叶枯病原菌感病性增强,表明木聚糖乙酰化修饰对白叶枯病抗病性极为关键。因此,这是水稻中首个系统研究的TBL蛋白。  另外,我们还对其它6个候选蛋白开展了初步的功能研究,包括创制相关的突变体遗传材料等。这些研究为我们了解水稻细胞壁中木聚糖的乙酰化机制和多糖乙酰化水平对作物农艺性状的影响积累了数据。同时也为纤维生物质在生物能源研制等方面的应用研究提供了依据。
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