研究背景：随着世界医疗水平的不断进步提高,世界人口的老龄化不断加剧,各种恶性癌肿逐渐成为造成人类死亡的主要原因。食管癌(esophageal carcinoma)是常见的一种上消化道癌肿,全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发区之一,每年约有15万人死于食管癌。发病率男多于女,发病年龄多在40岁以上。参与肿瘤的发生发展的因素很多,包括内在因素及外在因素。食管癌像其他的恶性肿瘤一样虽然有基因的变化背景,其涉及多因素、多阶段、多基因变异积累及相互作用的复杂过程。在分子水平上涉及众多原癌基因、抑癌基因以及蛋白质的改变。长期不良的生活或饮食习惯可能也是导致食管癌发生的元凶。目前认为,引起食管癌的相关危险因素主要有：进食含亚硝胺类较多的食物或霉变食品；长期喜进食较烫较硬的食物；吸烟及饮酒等不良嗜好；地理环境、气候条件、土壤性质的影响；自身肿瘤相关基因及遗传易感性的影响。我国是食管癌高发地区,食管癌死亡率位居肿瘤死亡的第四位。食管癌的治疗方法与其他癌肿大同小异,主要有外科手术切除、癌肿放射、化疗药物和免疫治疗等,但Ⅱ期以上的病例单一的治疗方法往往收不到满意的效果。故近年来多采用综合治疗,包括术前后放射治疗,手术切除后加用药物治疗等治疗方法。术后化疗主要针对术中达不到的区域,未清扫的淋巴结转移癌和癌细胞可能扩散到血液中。因此,为了消除这种隐患,从理论上说术后加以化疗是必要的。抗肿瘤的药物种类繁多,尤其近年抗癌新药层出不穷。临床上应用化学药物治疗实体肿瘤积累了丰富的经验,也收到了较好的效果。但是当前食管癌对现有的化疗药物多为中度甚至低度敏感,常规使用的化疗药物多以顺铂(PDD)和(或)5-氟尿嘧啶(5-FU)为主,其产生的化疗反应,如恶心呕吐较强烈以及对肝肾功能和骨髓损害等,一定程度上限制了其应用。且因为食管癌多数为分化程度差异较大的鳞状细胞癌,以及肿瘤细胞抗药性存在等因素,使较多患者对多种化疗方案不敏感,从而导致预后疗效较低,但仍较单纯手术切除治疗取的较好的预后治疗效果。正因为上述原因,目前新药研究中备受关注的是从中草药植物中提取的有效活性成分。说到从植物中萃取的有效活性成分,不得不提及紫杉醇。紫杉醇(paclitaxel)是从红豆杉树皮或其针叶中提取的新型活性抗肿瘤药物。经过多期临床试验,于1992年由美国联邦食品和药品管理局(FDA)批准上市。大量的实验及临床应用证实,从天然植物中提取的活性成分不仅对直接或间接杀死肿瘤细胞、联合化疗药物增加化疗效果及放疗过程的增敏中有一定效果。其副作用小,在一定程度上减轻化疗的不良反应,在一定程度上增强放化疗的效果及患者,特别是我国的患者,受益明显且理念上易于接受等优点获得国内外学者广泛的关注。关于天然植物中提取的活性成分的研究也取得了一定研究成果。我国有历史悠久的中医药学知识积累,又地大物博资源丰富,为从中草药中探寻有效地放疗化疗的增敏剂提供了厚实的研究基础,使得我国在该领域有较大的空间和广阔的前景。探索从天然植物从提取抗肿瘤或增敏放化疗的活性有效成分无外乎基于我国中医药基础理论,根据患者的“虚”“淤”“毒”等证型,以及中医药理论对肿瘤的辩证辨病的认识,对症使用的方药来探寻可能天然植物提取物的有效成分。中医文献中关于食道癌症状的描述有2000多年的历史,但中医没有这个病名,因此中医将食道癌及贲门癌称之为“噎膈”。就病名而言,噎,是指吞咽之时,梗噎不顺。膈,是胸膈阻塞,包含不下。噎和膈均可以单独出现,也可以是同时并存,这些症状和食道癌患者吞咽困难、饮食不下的症状非常相似。依据中医观点,使用的方药多为扶正固本、活血化瘀及清热解毒等。适合食管癌辩证辨病的这类中医药方药很多,关于这方面研究的也比较多。其中有研究者研究证实,从中草药汉防己的提取物中的汉防己甲素对食管癌细胞株Eca-109的放疗有增敏作用。汉防己甲素(Tetrandrine, Tet)是从多年生藤本防己科植物汉防己(Stephania tetrandra)的块根中提取的有效活性成分。在我国传统医学中,认为汉防己有祛风除湿、行气止痛及利水消肿等功效,主要用于消水肿、治疗风湿病及炎性疾病等。汉防己的化学成分较复杂,包括多种生物碱、挥发油及富含淀粉。汉防己提取物中的汉防己甲素的化学结构为一种双苄基异喹啉类生物碱,是其主要有效成分。目前经研究发现,汉防己甲素主要有抗过敏、抗心绞痛、抗肿瘤及抗高血压等作用,除此以外,其还在心律失常、神经性疼痛等方面具有一定疗效。有研究者发现汉防己甲素的抗肿瘤作用表现在增加化疗药物的敏感性,直接细胞毒作用,诱导细胞凋亡,逆转肿瘤细胞多重耐药性,增加对放射线的敏感性,对正常组织的防辐射保护以及抗远处转移等。据目前研究,汉防己甲素在增加化疗药物敏感性上是通过抑制肿瘤耐药细胞表面P-糖蛋白的过度表达功能,增加化疗药物在肿瘤细胞内的积聚,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。而在直接诱导细胞凋亡方面,发现汉防己甲素可导致抑癌的凋亡相关基因上调以及下调。在放疗增敏方面,发现可能与汉防己甲素影响细胞分裂周期相关蛋白的表达有关。生存素(Survivin)是近年来发现的与食管癌的发生相关的内源性凋亡抑制蛋白家族(inhibit of apoptosis family of proteins, IAPs)中的一员,也是唯一个细胞凋亡抑制因子。内源性凋亡抑制蛋白家族有较广泛的功能,包括参与信号传递途径、细胞分裂过程、新陈代谢以及帮助机体适应恶化的环境。研究发现Survivin可通过与凋亡途径中的末端蛋白酶Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9结合,下调Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的活性,从而抑制细胞的凋亡。研究目的：本研究通过对人食管癌细胞株Eca-109的增殖培养,并用不同浓度汉防己甲素作用于培养的食管癌细胞。通过四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定各个浓度作用下人食管癌肿瘤细胞吸光度来观察细胞的凋亡的情况,以此判断不同浓度汉防己甲素对食管癌细胞的凋亡诱导率不同以及是否有浓度依赖趋势。以及通过对不同浓度汉防己甲素作用下的肿瘤细胞进行Hoechst35528染色,明确随着汉防己甲素的浓度的增加,食管癌细胞凋亡数也随着增加。最后,通过蛋白质印迹实验(Western Blot)明确食管癌凋亡相关蛋白Survivin以及相关蛋白酶Caspase-3在不同浓度汉防己甲素的诱导下的表达情况。通过上述实验来探讨汉防己甲素(Tet)对人食管癌细胞株Eca-109的凋亡的促进作用的机制。研究材料和方法：1、通过对人食管细胞株Eca-109肿瘤细胞的增殖传代培养,培养出足够本次研究所需的人食管癌肿瘤细胞。2、设置6个梯度的给药组,每组3个平行培养孔,给予不同浓度的汉防己甲素(Tet)溶液,并设置空白对照组。3、每个给药组及空白对照组人食管癌Eca-109肿瘤细胞经培养48小时后,每个培养孔加入四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液。经反应充分后,将各个梯度组及空白对照组依次置于酶标仪在570nm下测定各个组的OD值,并按下列公式算出不同浓度的细胞的细胞凋亡诱导率,存活率(%)=(实验组OD值-空白对照组OD值÷(对照组OD值—空白对照组OD值)×100%,抑制率(%)=100%—存活率。半数抑制浓度IC50按下列计算：IC5o=lg-1[Xm—i×(∑P—0.5)],其中：Xm为设计的最大浓度的对数值；i为各浓度倍数比的浓度的对数值；∑P为各浓度组生长抑制率之和。4、取各个梯度给药组人食管癌肿瘤细胞,经培养48小时后,进行爬片,并予Hoechst35528染色。经染色后,将细胞置于荧光显微镜下观察并计数细胞凋亡指数。每个样本随机观察4个视野进行计数,计数1000个细胞,凋亡指数=凋亡细胞数/1000×100%。凋亡指数取前后2次计数的平均值。5、分别取30μmol/L、40μmol/L、50gmol/L的汉防己甲素干预人食管癌肿瘤细胞,培养48小时后,进行蛋白质印迹实验(western blot)经细胞裂解,BCA法对总蛋白浓度进行定量并进行封装。取每个培养孔上样50μg细胞总蛋白,分别加入一抗survivin (1:300)、Caspase-3(1:500)及β-actin(1：1000)及二抗IgG,以β-actin为内参,ECL发光试剂盒显影,并用GraphPad Prism5.0软件分析条带吸光值。6、应用SPSS13.0统计软件包进行统计分析,其中计量资料结果以x+s表示。处理组在不同浓度条件下对人食管癌肿瘤细胞细胞抑制率的影响采用析因设计资料的方差分析。以P<0.05认为差异具有统计学意义。研究结果：1、汉防己甲素(Tet)对食管癌细胞凋亡影响的测定。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定各实验组吸光度,将吸光度值换算成细胞活力,计算各浓度Tet对人食管癌Eca-109细胞凋亡的诱导率。结果显示,给药组细胞活力明显低于对照组,且在一定范围内具有浓度依赖性。在Tet浓度为50gmo1/L时,细胞活力达最低值。Tet对人食管癌Eca-109细胞凋亡的诱导作用随浓度增大呈现上升的趋势,当浓度为501.μmo1/L时,诱导细胞凋亡的活性基本达到最高值。结果显示各个组间均P<0.05有统计学意义。2、对各个浓度处理组经Hoechst35528染色,置于荧光显微镜下观察每个样本随机观察4个视野进行计数,计数1000个细胞。发现细胞凋亡数随着汉防己甲素浓度的增加有增加的趋势。结果显示给药组的活力明显低于对照组,且在一定范围内具有浓度依赖性。结果显示各个组间均P<0.05有统计学意义。3、分别用30、40、50μmo1/L的Tet干预人食管癌细施株Eca-109细胞48h后收集细胞,Western Blot结果显示,Survivin表达随着Tet浓度的减少,其表达逐渐增加；与β-actin条带的灰度比值分别为0.8457±0.0634,0.6798±0.0378,0.6185±0.0472,空白对照组为1.3672±0.1362,组间比较有统计学差异(P<0.01)。而caspase-3表达随Tet浓度的增加,其表达逐渐增加；与β-actin条带的灰度比值分别为0.5732±0.0678,0.8347±0.0802,1.0222±0.1034,空白对照组为0.4539±0.0478；组间比较差异具有统计学意义(分别与对照组比较：P<0.05,P<0.01,P<0.01)。研究结论：1、汉防己甲素对人食管癌细胞株Eca-109的细胞有诱导凋亡的作用,这种作用与汉防己甲素的浓度有一定的依赖关系。随着汉防己甲素的浓度的增加,诱导凋亡的人食管癌细胞株Eca-109的细胞就越多。在大于浓度约50μmol/L的汉防己甲素作用下,人食管癌细胞株Eca-109的细胞凋亡不再随着汉防己甲素的浓度的增加而增多。2、随着作用于人食管癌细胞株Eca-109细胞的汉防己甲素的浓度的增加,细胞所表达的Survivin蛋白浓度的也随之减少,有浓度依赖作用。同时,随着作用于人食管癌细胞株Eca-109细胞的汉防己甲素的浓度的增加,细胞所表达的Caspase-3蛋白浓度的也随之增加,也有一定的浓度依赖作用。3、本研究中人食管癌细胞株Eca-109细胞的凋亡,可能与汉防己甲素诱导食管癌细胞中的内源性凋亡抑制蛋白家族中的Survivin蛋白的表达下调以及使凋亡途径中的末端蛋白酶Caspase-3蛋白的上调有关。