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研究背景及目的:肺癌是当今社会上最常见的恶性肿瘤之一,在常见的因疾病而死亡的原因中排名第一。我国作为一个经济发展中国家,由于人们的身体素质和生活质量不如发达国家,医疗水平和科学技术略显匮乏,因此肺癌发病率和死亡率的上升趋势尤为显著。新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）属于禽Ⅰ型副黏病毒科副黏病毒属,为单股负链RNA病毒。当禽类养殖业遭遇NDV的袭击时,若不幸发生大面积广泛传播,将对禽类养殖业造成巨大伤害。除引起禽病外,NDV对人类也有有益的一面,它可以诱发肿瘤细胞凋亡,而对人体多数正常细胞或组织没有损伤或损伤较小,因而成为溶瘤病毒家族中极具潜力的候选病毒。NDV可以通过诱发肿瘤细胞凋亡而达到抗癌的目的,其机制的阐明是解锁NDV生物治疗的关键钥匙之一。近年来,miRNA参与调控肿瘤细胞凋亡的研究表明miRNA能够通过转录后调节级联信号通路来影响细胞凋亡的生物学过程。那么,我们以“凋亡途径是NDV抗肿瘤的主要途径”为出发点,再结合“miRNA参与肿瘤细胞凋亡调控”,提出“NDV诱导肿瘤细胞的凋亡是否存在miRNA的调控”这个科学问题。拟以“miRNA调控”为切入点,选择参与肿瘤细胞凋亡调控的miRNA-204为研究对象,探讨miRNA在NDV促肺癌细胞凋亡中的作用,项目的完成将有助于我们对NDV的溶瘤机制进一步认识,也为基于“NDV-miRNA-肿瘤细胞”生物治疗策略提供新的理论依据。方法:1.利用不同效价的NDV-7793病毒体外作用于人肺腺癌A549细胞,采用CCK-8法检测24 h、48 h和72 h三个时间点病毒作用后的人肺腺癌A549细胞的存活率,筛选出最佳病毒效价以及感染时间。采用该效价的病毒体外感染人肺腺癌A549细胞,通过显微镜观察细胞病变（Cytopathic Effect,CPE）,TUNEL法荧光显微镜下观察细胞凋亡情况,进一步确定NDV-7793是否能够成功感染A549细胞并使其发生凋亡。2.将体外作用A549细胞的处理实验分为六组,分别是NDV-7793组（NDV-7793）、紫外灭活NDV-7793组（UV-NDV-7793）、流感病毒BR07组（BR07）、紫外灭活流感病毒BR07组（UV-BR07）、抗癌药物组（顺铂）和空白对照组（PBS）。采用RT-PCR法分别检测各组A549细胞24 h、48 h和72 h的miRNA-204表达情况;血凝实验检测NDV-7793组三个时间点细胞上清液的血凝素神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase,HN）效价;流式细胞术检测六组在24 h、48 h和72 h的A549细胞的凋亡率;RT-PCR检测六组三个时间点凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax的表达;3.验证试验:采用转染miRNA-204抑制物的方法建立去表达miRNA-204的A549细胞模型,在模型中设置inhibitor组和inhibitor-nc组。然后用NDV-7793体外作用经miRNA-204抑制物转染预处理后的A549细胞,采用RT-PCR法检测miRNA-204的表达情况;流式细胞术检测A549细胞的凋亡率;RT-PCR、Western Blot法检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax的表达。结果:1.成功扩增NDV-7793病毒;经CCK-8检测得出,在体外作用A549细胞的不同HN效价的NDV-7793病毒组中,HN为1:2048的NDV-7793体外作用48 h的A549细胞的存活率最低且稳定,因此后续实验均选择HN为1:2048的NDV-7793病毒进行研究且最佳感染时间为48 h。在病毒致细胞病变效应观察中,我们发现NDV-7793体外作用24 h时,细胞状态开始出现改变,48 h大量细胞明显皱缩、变圆并不再贴壁,72 h细胞大量死亡;TUNEL法荧光显微镜下观察显示NDV-7793组A549细胞出现大量绿色荧光,即NDV-7793能够引起A549细胞凋亡。2.RT-PCR结果显示NDV-7793组miRNA-204表达量最高,且显著高于其他五组,随着时间的延长,表达量呈递增趋势,差异具有统计学意义,同时发现,在72 h内NDV-7793组细胞上清液HN效价随时间延长呈递增趋势;流式细胞术显示NDV-7793组细胞凋亡率最高,且显著高于其他五组,与时间正相关,呈递增趋势,差异具有统计学意义;RT-PCR显示NDV-7793组的Caspase-3、Bax表达量最高,且显著高于其他五组,差异具有统计学意义。以上结果提示miRNA-204可能是NDV-7793引起人肺腺癌A549细胞凋亡的特异性miRNA,并且能通过影响凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax的表达来促进NDV-7793致A549细胞凋亡的作用。3.验证试验:通过转染的方法成功建立去表达miRNA-204的A549细胞模型。结果显示抑制miRNA-204表达的inhibitor组的miRNA-204表达量明显低于抑制对照inhibitor-nc组,且inhibitor组细胞凋亡率以及Caspase-3、Bax的表达量均低于inhibitor-nc组,差异均有统计学意义。结论:1.NDV-7793能够感染人肺腺癌A549细胞,并引起A549细胞发生凋亡;2.NDV-7793可以引起人肺腺癌A549细胞内miRNA-204的高表达,从而上调凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表达,最终导致人肺腺癌A549细胞的凋亡。