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研究背景:胰岛移植治疗已被证实可以使1型糖尿病病人血糖恢复正常化,同时可以有效地延缓糖尿病并发症的发生,是一种有治愈糖尿病可能的治疗方法,具有较广阔的发展前景,但胰岛移植的发展受到胰岛供体匮乏、移植胰岛的存活率低的阻碍。已有研究表明,骨髓间充质干细胞(BMSCs)与胰岛共移植能大大提高移植胰岛的存活率。而PI3K-AKT信号通路作为一个广泛存在于各种细胞中的,对细胞的存活具有重要影响的信号通路,是否会在骨髓间充质干细胞促进移植胰岛的存活中起着重要作用尚有待研究。研究目的:本研究拟通过将小鼠骨髓间充质干细胞与小鼠胰岛体外共培养,应用台盼蓝染色显微镜下计数法,计算胰岛的存活率,验证骨髓间充质干细胞对胰岛存活的促进作用。应用PI3K-AKT信号通路特异性抑制剂LY294002,进一步探讨PI3K-AKT信号通路在骨髓间充质干细胞与胰岛共培养中的作用。研究方法:1、小鼠胫骨、股骨髓腔内提取的细胞进行体外培养,24h后经过鼓吹、初次换液后留取贴壁圆形及部分梭形细胞继续培养,48h左右后可见甁腔内贴壁细胞生长为细长梭形细胞,约72h后大部分骨髓间充质干细胞可伸出伪足,逐渐呈现为梭形并聚集成多角形的规则形态,细胞之间相互靠近、融合,且增殖速度逐渐加快。经过多次消化传代,获得较高纯度的骨髓间充质干细胞;2、应用胶原酶灌注法及Ficoll-400密度梯度离心法提取并提纯小鼠胰岛,用双硫腙染色法和葡萄糖刺激实验鉴定胰岛并确定其功能完整,用台盼蓝染色法显微镜下鉴定胰岛的存活。3、将提取获得的骨髓间充质干细胞与胰岛进行分组:单纯胰岛组(1组)、PI3K-AKT信号通路抑制剂LY294002预处理后的胰岛组(2组)、BMSCs与胰岛共培养组(3组)、PI3K-AKT信号通路抑制剂LY294002预处理后的胰岛与BMSCs共培养组(4组)。在高糖条件下进行细胞培养,取第3天、第5天、第9天、第13天胰岛进行台盼蓝染色,显微镜下计数胰岛存活率,分析数据,证明PI3K-AKT信号通路在骨髓间充质干细胞与胰岛共培养中的作用。结果:1、从小鼠胫骨、股骨中提取骨髓间充质干细胞,利用骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性,应用换液及传代培养法对骨髓间充质干细胞进行提纯,最终获得增殖速度快,纯度高的骨髓间充质干细胞;2、应用胶原酶灌注法及Ficoll-400密度梯度离心法成功提取并提纯小鼠胰岛,通过染色法及葡萄糖刺激实验,证实提取胰岛结构及功能完整;3、高糖条件下分组培养骨髓间充质干细胞及胰岛,第3组的胰岛存活率于第3、5、9、13天均明显高于第1组,且差异具有统计学意义,证明了骨髓间充质干细胞对胰岛具有促存活作用;而第3、5、9天时第2组和第4组的胰岛存活率大致相同,差异无统计学意义,第13天时两组均无存活胰岛,反映了骨髓间充质干细胞对PI3K-AKT信号通路抑制后的胰岛的促存活作用消失,证明了PI3K-AKT信号通路在骨髓间充质干细胞促胰岛存活中起着重要作用。结论:体外共培养状况下,骨髓间充质干细胞对胰岛具有促存活作用。而PI3K-AKT信号通路在骨髓间充质干细胞促胰岛存活中起重要作用。