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胰腺癌是一种发病隐匿、高度恶性的消化道肿瘤,多数患者就诊时已属中晚期,手术切除率低,术后复发、转移早,对放化疗均不敏感,预后差。随着基因治疗研究的进展,近十年来,RNA干扰(RNAi)技术得到了广泛运用,肿瘤的基因治疗研究进入到了一个快速发展的阶段。目前基因治疗研究中采用的RNA干扰技术基本上都是以非编码的小干扰RAN(siRAN)作为效应分子,虽然成绩斐然,但其也有不足之处:对高等生物而言,它不是一种内源性作用机制,siRNA干扰存在靶向不确定现象。而另一种小分子——microRNA(miRNA)的应用价值理论上要更优于siRNA,其主要优势在于作用机制:不仅可以通过经典RNAi途径降解靶mRNA,而且可以通过快速脱腺苷化降解靶mRNA及直接抑制靶mRNA的翻译。这种机制的多样化使miRNA具有了一定的容错能力——与靶mRNA不需要严格的完全互补仍可以发挥其调控效应,有利于保证其靶向治疗的稳定。STAT3是信号转导通路中的一个重要因子,在许多原发性肿瘤中大多处于持续活化的状态。它和肿瘤的发生、发展及预后关系密切,是肿瘤基因治疗研究的一个重要靶标。本实验模拟天然miRNA,构建靶向STAT3mRNA的miRNA表达质粒,通过体外和体内实验观察miRNA转染胰腺癌细胞后对STAT3的调控效应。为此,整个实验分三部分进行:第一部分:靶向STAT3mRNA的miRNA质粒的构建和有效质粒筛选。目的是确定针对STAT3mRNA的miRNA的有效作用位点,观察构建的表达质粒转染胰腺癌Panc-1细胞后对STAT3的调控效应,筛选出了调控基因表达的有效质粒。结果针对STAT3mRNA的序列分别构建了4个候选质粒,瞬时转染Panc-1后,通过检测STAT3mRNA及STAT3蛋白的表达,从中筛选出了一个最有效的质粒:miRNA-STAT3-1。确定了其作用位点为STAT3基因的1242～1262序列。RT-PCR检测结果为miRNA-STAT3-1质粒转染使STAT3mRNA水平下降了78.5%,Western blot结果为蛋白表达下降了89.1%。MTT法检验表明Panc-1细胞增殖被抑制。流式细胞术检测表明细胞周期阻滞在G1/G0期,肿瘤细胞早期凋亡比率增加。第二部分:建立稳定表达候选miRNA的Panc-1细胞系并观察其对STAT3的调控效应。目的是建立稳定表达候选miRNA并具有确切调控效应的Panc-1细胞株,为体内实验提供必要的实验条件。结果表明经抗生素筛选后成功建立了稳定表达miRNA-STAT3-1质粒的Panc-1细胞株,RT-PCR结果为STAT3mRNA水平下调了约53%,yclin-D1mRNA下降了约57%,Bcl-2mRNA水平下降了约33%。Western blot结果为STAT3蛋白水平下调了约39%,Cyclin-D1蛋白下降了约30%,Bcl-2蛋白水平下降了约17%。第三部分:裸鼠体内实验。目的是通过胰腺癌裸鼠移植瘤模型。观测移植瘤生长情况及检测蛋白表达变化。结果表明成功建立了胰腺癌裸鼠移植瘤模型,验证了靶向STAT3的microRNA对Panc-1移植瘤有抑瘤作用。实验最后得到的结论如下:1、体外重组成功构建了靶向调控STAT3 mRNA基因的4种miRNA质粒载体,人工构建的miRNA质粒载体对STAT3 mRNA实现了有效的调控,下调了靶基因的表达,确定了STAT3基因的位点1242～1262是miRNA调控的高效作用位点。2、在瞬时转染及稳定转染中证实了STAT3mRNA的表达水平下调,蛋白表达水平下降。在瞬时转染中,胰腺癌细胞的生长缓慢,增殖被抑制,细胞周期阻滞于G1/ G0期,诱导了细胞的凋亡。3、成功构建了人胰腺癌裸鼠移植瘤模型,表达microRNA的高效重组质粒的胰腺癌移植瘤组织中的STAT3蛋白表达水平受到抑制,肿瘤的生长受到了抑制,达到了通过人工构建合成miRNA转染抑制胰腺癌的目的。