真菌感染疾病是皮肤科临床中最常见的疾病之一,占皮肤科总门诊量的50%左右。近年来随着抗生素和免疫抑制剂的广泛应用、肿瘤、艾滋病、器官移植的增加以及环境的恶化,真菌感染的发病率逐年增高,其中环境因素已成为多种疾病发生和加重的重要因素。由于臭氧层的破坏,地球表面紫外线辐射量增加,使得紫外线的危害更加严重。紫外线对各种疾病如细菌、病毒感染及肿瘤等疾病的影响已有大量研究报道,但紫外线对真菌感染的影响仍未明确。环境中紫外线包括UVA(320～400nm)、UVB(280～320nm)、UVC(<280nm)。目前,关于紫外线的研究大多集中于UVA和UVB,关于UVC的研究报道甚少。UVA和UVB对皮肤影响包括引起红斑、色素沉着、物理结构损害及免疫损伤等,但两者引起皮肤光损伤的临床表现及机制可能存在差异,至今仍无详尽文献报道。真菌是真核生物,从传统形态学上可分为酵母相和菌丝相。目前已发现致病真菌约400多种。多数真菌在环境中普遍存在,并可熟练感知周围环境变化,产生适应性反应从而促进其在恶劣多变的环境中生存。这一特性促使它们可与植物、动物或人等宿主发生相互作用,形成共栖状态、潜伏感染或致病状态。真菌感染的发生除了真菌自身毒力因素的作用外,宿主防御系统也对其有重要影响,并决定着真菌感染的转归和预后。作为机体的首道防御屏障,皮肤的屏障功能有广义与狭义之分。广义的皮肤屏障不仅包括皮肤的物理屏障作用,还包括皮肤的免疫屏障、色素屏障、神经屏障等；狭义皮肤屏障指皮肤的完整性结构,尤其是角质层与其间脂质构成的“砖墙结构”。皮肤屏障的结构基础主要是角质层、脂质和多种天然保湿因子。此外,表皮各种蛋白质、无机盐等也是其重要组成部分。表皮脂质包括神经酰胺、丰富的磷脂、游离胆固醇及不饱和脂肪酸等,这些脂质在基底细胞向角质层分化过程中含量逐渐增高,到达角质层时从细胞间隙排出,形成防止水分丢失的屏障。天然保湿因子是由表皮中间丝相关蛋白分解而成,对保持皮肤水合作用有重要意义,常见的天然保湿因子包括某些氨基酸、吡咯烷酮羧酸、尿刊酸、尿素等多种低分子物质。免疫屏障包括以T细胞、朗格汉斯细胞、吞噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞等为主的细胞水平免疫,同时还包括以各种细胞因子、肿瘤坏死因子、尿刊酸、抗微生物肽等为主的分子水平免疫。迄今为止,已有相关文献报道紫外线对皮肤屏障的影响,及紫外线照射对皮肤发生细菌、病毒感染及肿瘤等的影响,但对真菌感染影响的研究较少；并且多数实验研究UVA、UVB的单独作用及其机制。但环境中紫外线是UVA与UVB以一定比例联合照射,从而影响皮肤屏障功能。因此,本研究利用SUV-1000日光紫外线模拟器作为光源,经预实验后选择适合的动物作为实验对象,选取亲动物性致病真菌中最常见的须癣毛癣菌为实验菌株,构建不同剂量紫外线照射后皮肤日晒伤模型,并检测皮肤屏障改变从而研究模拟日光导致皮肤屏障损伤的机制。同时构建紫外线照射后须癣毛癣菌感染模型,进一步研究紫外线照射后皮肤屏障损伤与真菌感染的相关性和相关机制,以期为创伤性真菌感染的防治研究提供基础。1.目的：分别检测豚鼠、C57BL/6、ICR小鼠的最小红斑量,并确定何种为本实验最适实验动物。2.方法：利用SUV-1000日光模拟器作为光源,MED测定器被分为剂量依次递减的8个照射孔,每次照射前利用UVA、UVB辐照计测出光源输出功率。豚鼠10只,每只照射1组(即8个)光斑剂量；C57BL/6、ICR小鼠分别30只,分别每3只为1组,每只依次照射2个光斑,即1组6个光斑剂量。将实验动物备皮,照射时固定于模拟日光照射仪光源下,使皮肤紧贴照射孔,同时遮蔽眼睛使其免于模拟日光照射。豚鼠8孔照射剂量范围UVA约为160～2500mJ/cm2,UVB约为15～200mJ/cm2,由小到大以约1.414倍递增；C57BL/6、ICR小鼠6个光斑照射范围UVA约为100～1800mJ/cm2,UVB约为10～160mJ/cm2,由小到大以约1.414倍递增。照射后观察48小时内各组小鼠皮肤红斑反应情况,以照射后24小时各组出现可见红斑的最小照射剂量为各组最小红斑量,三种实验动物最小红斑量分别求均值,记为三种鼠的最小红斑量。3.结果：模拟日光照射后计算三种鼠的最小红斑量,C57BL/6小鼠UVA498mJ/cm2,UVB42mJ/cm2,总剂量540mJ/cm2；ICR小鼠UVA644.9mJ/cm2,UVB55.4mJ/cm2,总剂量700.3mJ/cm2；豚鼠UVA1430mJ/cm2,UVB122mJ/cm2,总剂量1552mJ/cm2。综合考虑模拟日光照射操作方式、实验动物备皮处理的影响及后期真菌感染实验操作等因素,选取豚鼠为本实验的最适实验动物。1.目的：构建模拟日光照射导致皮肤光损伤动物模型及光损伤后须癣毛癣菌感染动物模型,研究模拟日光照射与皮肤屏障损伤及其与须癣毛癣菌感染的关系。2.方法：(1)模拟日光照射及照射后真菌感染利用SUV-1000日光紫外线模拟器照射豚鼠背部皮肤,测出其MED后。将70只实验豚鼠分为5组,第1、2、3、4组分别以0MED、0.5MED、1MED、4MED连续3天照射其背部备皮后皮肤,每次照射前重新备皮。连续3天照射完成后次日,每组随机抽取6只检测其皮肤屏障改变。完毕后将预先制备的须癣毛癣菌悬液均匀涂抹于每组剩余豚鼠照射部位皮肤。第5组为空白对照组,脱毛后不进行照射,背部涂抹生理盐水以做对照。自然晾干后放置于笼中单独饲养,自接种之日起观察豚鼠背部皮肤临床表现的变化,为期28天,出现红斑、脱屑、结痂、糜烂各计为1分,同时出现多种临床表现时分数累加。(2)照射后皮肤屏障检测各组分别照射完毕后次日,每组分别随机抽取6只,10%乌拉坦麻醉后于照射部位用皮肤钻孔器取全层皮肤,10%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片后行HE染色及CD4+、CD8+T细胞抗体染色。同时取豚鼠背部皮肤引流淋巴结,即腹股沟淋巴结,10%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片后行HE染色及CD4、CD8抗体染色。(3)真菌感染鉴定真菌感染鉴定方法采用真菌镜检、真菌培养和组织病理方法。真菌直接镜检和培养于接种后4日开始,刮取豚鼠背部皮屑及毛发,进行显微镜下10%氢氧化钾常规镜检,并留取少量皮屑及毛发,接种于含氯霉素和放线菌酮的SDA培养基上,每隔4天进行一次,至感染后第28天,观察皮肤及毛发真菌感染情况。真菌培养后7-10天,观察培养菌落形态,并利用无菌接种针挑取少许培养菌落进行乳酸酚棉兰染色和PDA小培养,显微镜下鉴定。接种后第10天,每组豚鼠中随机抽取2只处死,于感染部位取皮肤全层组织进行PAS染色,进一步鉴定感染结果。(4)统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计学分析。1、2、3、4组感染后评分数据以均数±标准差(x±s)表示。多组比较采用重复测量设计资料的方差分析,若数据满足球形检验,结果不需要校正；若不满足球形检验,则采用校正的Greenhouse-Geisser法。两两组间比较采用LSD检验。各组评分-时间曲线下面积、最初感染时间和到达最高分值时间以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较,若方差齐同采用LSD检验,方差不齐采用Tamhane’sT2检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。3.结果：感染后大体改变：第5组空白对照组未发生感染变化,第3、4于接种后3天即出现皮肤红斑反应,第2组接种后第4天出现红斑,第1组空白感染组接种后第5天开始出现皮肤红斑反应。感染中期,同一天各组豚鼠皮损第4组临床表现较1、2、3组明显严重。第1、2组于感染后21出现个别豚鼠皮损恢复,表现为痂皮脱落,遗留红斑及少量脱屑；第3、4组感染后皮损于23天始逐渐恢复。对感染过程中各组豚鼠皮损评分进行统计学分析结果显示：4组评分组间差异有统计学意义(P=0.049)。4组评分组间差异有统计学意义(P<0.001),第4组皮损评分与1、2组差异均有统计学意义(P值分别为0.022、0.037),第4组与第3组差异无统计学意义(P=0.108),第1、2、3三组之间两两比较,差异均无统计学意义(1、2组比较P=0.747,1、3组比较P=0.377,2、3组比较P=0.503)。4组曲线下面积组间比较无统计学差异(P=0.070),最初感染时间组间比较无统计学差异(P=0.066),达到最高分值的时间无统计学差异(P=0.729)。皮肤屏障功能检测结果表明,照射后可见不同程度物理屏障损伤,并随照射剂量增加呈现加重趋势。皮肤CD4+、CD8+T细胞免疫组化染色,第1组未照射组背部皮肤和淋巴结中均可见CD4表达和CD8少量表达。第2、3、4组皮肤和淋巴结中CD4表达强度均较第1组下降,CD8表达强度有增加的趋势。真菌检查结果显示第1、2、3、4组豚鼠真菌全部为阳性,第5组空白对照组未见真菌感染。第1-4组豚鼠于接种须癣毛癣菌后第4天刮取背部皮屑,直接镜检结果全部阳性,培养结果通过观察菌落形态、乳酸酚棉兰染色及小培养鉴定全部为须癣毛癣菌。第1-4组豚鼠皮肤组织切片PAS染色镜下可见角质层、毛根及毛干内大量孢子及少量菌丝分布,染成深红色,第5组未见菌丝及孢子。结论：1.豚鼠、C57BL/6、ICR小鼠三种动物最小红斑量实验结果表明,豚鼠更适合模拟日光照射后真菌感染实验。其优点在于：背部面积较大,可8孔光斑同时照射在一只豚鼠上,减少最小红斑量误差；采用硫化钡脱毛,对皮肤的损伤较小性情温和,模拟日光照射时便于操作；其背部皮肤更易接种真菌,并且便于观察感染后临床表现。2.以大于或等于最小红斑量的模拟日光照射后,豚鼠皮肤可发生日晒红斑反应,小于最小红斑剂量照射不出现红斑反应；模拟日光照射后皮肤屏障发生明显损伤,并且在一定照射范围内随剂量增加皮肤损伤呈加重趋势；模拟日光照射剂量对真菌感染的发生率无影响,实验结果显示照射组和非照射组豚鼠感染阳性率均为100%；但模拟日光照射剂量对真菌感染后皮肤损害的严重程度及皮损自愈有显著影响,表现为随照射剂量增加照射后感染皮损更严重并且皮损自愈时间更长。根据上述结果,我们可推断模拟日光照射后皮肤屏障损伤可能是真菌感染严重程度差异的基础,但是两者之间的相关机制有待于我们深入研究。