猪圆环病毒2型（PCV2）是单股负链环状DNA病毒,基因组长度1 767～1 768 bp,病毒粒子呈二十面体对称结构,无囊膜,病毒粒子大小约17 nm。PCV2导致猪免疫系统损害和抑制,严重损害猪的健康,并常继发或混合感染其他病原体,造成更为严重的损害。对PCV2的致病机制的揭示有助于更好的做好防控工作,对病毒编码产物的鉴定和功能研究是揭示PCV2致病机制的基础。生物信息学分析发现,PCV2的基因组中至少包含11个潜在的开放阅读框（ORF）,目前报道的有6个（ORF1-6）,其中ORF5是本研究团队发现和鉴定的一个PCV2新编码蛋白。前期研究结果表明,ORF5蛋白可引起宿主细胞周期阻滞,诱导内质网应激反应和细胞自噬,促进病毒复制等,以上结果主要是以ORF5蛋白为研究对象获得的,在ORF5在病毒水平的作用还需要深入研究。本研究克隆获得了PCV2全基因组序列,通过点突变技术将ORF5基因的起始密码子（ATG）突变,拯救获得了PCV2克隆毒株（rPCV2）和ORF5基因突变毒株(PCV2△ORF5)。进一步研究了ORF5对病毒生长特性、细胞感染作用,实验动物感染方面的作用,在病毒水平明确了ORF5的作用,为PCV2致病机制的揭示提供了新的资料。本研究获得了以下结果:（1）获得了PCV2克隆毒株和ORF5基因突变毒株克隆获得PCV2全基因,分别构建插入PCV2全基因序列的重组质粒PUC57-rPCV2和突变ORF5基因的重组质粒PUC57-PCV2△ORF5,经单酶切、体外自环化连接、连接产物转染细胞、盲传等实验操作,分别获得了rPCV2和PCV2△ORF5毒株。（2）ORF5基因突变降低了病毒复制增殖及诱导细胞内质网应激、细胞自噬的作用以rPCV2、PCV2△ORF5毒株分别感染猪肺泡巨噬细胞3D4/21,分别用透射电镜观察法、RT-PCR、western blot、流式细胞术等方法对病毒复制增殖、对细胞功能的影响进行分析。结果表明,rPCV2、PCV2△ORF5毒株在细胞中的复制增殖具有一致性,但ORF5基因突变在36h时显著降低了病毒的复制增殖能力（P<0.05）;rPCV2、PCV2△ORF5毒株均诱导了细胞内质网应激、细胞自噬和细胞凋亡,但是ORF5基因的突变使感染细胞的内质网应激、细胞自噬、细胞晚期凋亡和细胞周期阻滞作用显著降低（P<0.05或P<0.01）。研究结果从病毒水平证实了ORF5蛋白在病毒感染中具有诱导宿主细胞内质网应激、细胞自噬和细胞周期阻滞的作用。（3）ORF5基因突变降低了病毒在实验动物体内的复制增殖、诱导细胞内质网应激和细胞自噬作用分别用PCV2、rPCV2、PCV2△ORF5病毒液通过腹腔注射途径接种昆明系小鼠4次,每天1次,4此接种后每隔7 d尾静脉采血,荧光定量PCR方法检测血液中的病毒载量;当感染小鼠血液中出现高滴度病毒载量时（感染后28 d）麻醉处死各组小鼠,无菌操作分别采取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等组织器官,RT-PCR和western blot检测各组织中的病毒载量、内质网应激和细胞自噬标志因子的表达;将各组织器官分别制成电镜和普通病理切片,进行观察。结果显示,三种病毒感染小鼠的肝、脾、肾、肺中病毒载量均较高,但PCV2△ORF5组感染小鼠相同组织中的病毒载量低于PCV2和rPCV2组（P<0.01或P<0.05）,说明ORF5基因突变降低了病毒在动物体内的复制增殖能力;病毒载量与组织中内质网应激和细胞自噬标志因子的表达呈正相关性,肝、脾、肾和肺中GRP78、Beclin1和LC3Ⅰ/Ⅱ的表达高于其他组织（P<0.01或P<0.05）,但PCV2△ORF5组感染小鼠相同组织中的标志因子表达显著低于PCV2和rPCV2感染组,说明ORF5基因突变降低了病毒诱导细胞内质网应激和细胞自噬的作用。通过病理组织学观察结果显示,三种病毒感染的小鼠组织中出现炎性细胞浸润、淋巴细胞减少、细胞凋亡、细胞变性等病理变化,但各组之间无显著差异。研究结果表明,ORF5基因突变对病毒感染性和病理变化无显著影响,但是降低了病毒的复制增殖、诱导细胞内质网应激和细胞自噬作用。本研究构建了突变ORF5基因的PCV2毒株,ORF5的突变降低了病毒在体内外的复制增殖水平,降低了病毒在体内外诱导细胞内质网应激和细胞自噬作用,但对病毒的感染性和病理损伤无显著影响。本研究从病毒和体内外进一步明确了ORF5在PCV2感染中的作用,为PCV2感染和致病机制的阐明提供了新的资料,具有理论和潜在的应用价值。