背景近年来,急性心肌梗死的死亡率在我国一直走高,疾病负担日趋沉重。虽然溶栓治疗、心脏介入手术等治疗策略使心肌梗死预后有了较大改观,但仍有许多病人发生梗死后心室重构,并且有许多病人最终进展为心力衰竭。急性心肌梗死后心力衰竭的主要病生机制就是心室重构,近年来,如何减缓或逆转急性心肌梗死后心室重构已成为基础与临床研究的热点。心肌梗死后后心室重构涉及多个过程,例如心肌细胞肥大,细胞外基质合成增加及沉积,血管的增生等。在心肌梗死发生的起始阶段,细胞外基质合成及沉积逐渐增多,一方面，可以使心脏收缩力增强,另一方面,产生瘢痕可以防护心脏发生破裂,具有改善心脏功能的作用;随着心肌梗死的发展,到了心肌梗死后期,细胞外基质大量的沈积可以引起心肌纤维化,并最终进展成为心力衰竭。因此,过度的心肌纤维化是心室重构中的重要病理改变。众多的研究发现,心肌梗死发生的过程中,梗死区会不间断的出现细胞外基质的合成、沉积,梗死区甚至在数年后仍然能观察到细胞外基质重塑,并且处于激活状态。因此,探讨心肌纤维化的激活机制和调控手段,可为改善心肌梗死的预后提供有效的策略。心肌纤维化发生过程中,最重要的效应细胞就是心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs),其增殖活化足心肌纤维化的重要环节。CFs是心脏细胞外基质蛋白的主要分泌细胞,可分化为肌成纤维细胞,从而合成及分泌更多的细胞外基质蛋白。CFs的持续增殖及分化势必会造成心肌的纤维化发生。因此,限制CFs的增殖和分化可为减少病理性心肌纤维化提供有潜力的措施。越来越多的研究表明微小核糖核酸(micro RNA,miRNA)在心肌纤维化中发挥着重要的作用。miRNA是一类高度保守的非编码小分子RNA,其可通过与靶基因的3’端非翻译区(3’ UTR)上的对应的靶点结合,降解或者抑制靶基因表达而发挥调控作用。miRNA不单单在心血管系统发育中有重要作用,而且在心脏病理生理方面也起着重要作用,如心肌肥厚、心肌缺血等。研究发现,在先天性心脏病、心肌肥厚(生理性或病理性)及心力衰竭中均存在着miRNA表达的改变,这提示miRNA在心室重构中可能有关键性作用。在众多的miRNA中,微小核糖核酸-125b(micro RNA-125b,miR-125b)的作用尤其重要。研究发现,miR-125b在人心力衰竭的心肌组织和其它实验动物模型心肌组织中的表达呈明显上调水平,从而表明miR-125b可能是心肌重构的特征性分子。因此,miR-125b在心血管疾病中可能具有重要价值。但目前关于miR-125b在心肌纤维化中的机制还不清楚,值得我们深入研究。我们的研究目的就是通过体外体内实验来探讨miR-125b对CFs功能的具体调控作用,筛选其靶基因,验证这一调控作用是否通过Wnt/β-catenin信号通路来完成。本项研究分为三个部分。第一部分目的:探讨miR-125b对人CFs合成胶原、活化、增殖和迁移功能的调控作用,以及miR-125b对细胞凋亡的影响。方法:体外培养人CFs,分为4组:空白对照组,阴性对照组,miR-125b模拟物转染组和miR-125b抑制物转染组。分别将miR-125b模拟物和抑制物转染到人CFs中,使用实时荧光定量PCR、Western blot检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达水平及Western blot 检测 α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)(CFs 活化标志物)表达水平;使用BrdU法检测细胞增殖情况;使用Transwell细胞迁移检测细胞迁移能力;使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,最终明确miR-125b在CFs中的具体作用。结果:1.实时荧光定量PCR及Western blot检测显示,转染miR-125b模拟物可上调CFs中Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达水平(P均<0.05);转染miR-125b抑制物则下调Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达(P均<0.05)。2.Western blot 检测显示,miR-125b 模拟物可促进 CFs 表达 α-SMA(P<0.05);转染miR-125b抑制物则可以抑制CFs表达α-SMA(P<0.05)。3.BrdU增殖检测显示,转染miR-125b可促进CFs的细胞增殖(P<0.05);转染miR-125b抑制物则可抑制其细胞增殖(P<0.05)。4.Transwell细胞迁移检测显示,转染miR-125b模拟物后,miR-125b表达上调可增强CFs细胞迁移能力(P<0.05);转染miR-125b抑制物则使其迁移能力显著下降(P<0.05)。5.流式细胞仪检测细胞凋亡显示:转染miR-125b抑制物后,CFs早期凋亡和晚期凋亡水平均明显提高(P均<0.05);转染miR-125b模拟物后,CFs凋亡水平有所下调,但差异无统计学意义。结论:1.miR-125b加强CFs合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原能力。2.miR-125b促进CFs向肌成纤维细胞转化。3.miR-125b促进CFs细胞增殖和迁移能力。4.抑制miR-125b表达可以促进CFs细胞凋亡。第二部分目的:探索并验证miR-125b在TGF-β1信号通路或Wnt/β-catenin信号通路上是否存在靶基因。方法:使用生物信息学算法预测miR-125b的靶基因,根据功能及文献报道进行筛选后,使用荧光素酶实验进行验证。将miR-125b潜在靶基因的3’UTR克隆到双荧光素酶报告载体psiCHECK-2中;将miR-125b潜在靶基因的3’UTR进行突变并克隆到双荧光素酶报告载体psiCHECK-2中。最后分别把两个质粒及miR-125b转染入CFs,分析荧光素酶活性变化,明确miR-125b所调控的靶基因。结果:1.预测 miR-125b 候选靶基因有 MMP14、MAPK1、SFRP5、FGFR3 和 FGF15等,结合KEGG数据库中基因功能、现有文献及既往研究基础,最终选择SFRP5进行进一步的验证实验。2.转染野生型SFRP5-3’UTR的CFs中,荧光素酶活性与空载体对照组相比降低45%左右,差异明显(P<0.05);将预测的miR-125b靶基因突变后的突变型SFRP5-3’UTR转染入CFs中后,荧光素酶活性与空载体对照组相比无明显差异。结论:SFRP5是miR-125b的下游靶基因。第三部分目的:体内外实验验证miR-125b是否通过调控SFRP5影响CFs合成胶原、活化、增殖及迁移功能及抑制miR-125b表达对心梗后心肌组织形态的影响。方法:1.在体外培养人CFs,分为7组:空白对照组,阴性对照组,miR-125b抑制物转染组,miR-125b模拟物转染组,SFRP5过表达载体转染组,SFRP5siRNA转染组,miR-125b模拟物+SFRP5过表达载体转染组。分别将miR-125b模拟物和抑制物转染入进人CFs,实时荧光定量PCR检测SFRP5 mRNA表达;分别将miR-125b模拟物和抑制物,SFRP5过表达载体和SFRP5 siRNA,以及miR-125b模拟物+SFRP5过表达载体等分组转染入到人CFs中,Western blot检测SFRP5,Ⅰ型和Ⅲ型胶原及α-SMA等蛋白表达水平;BrdU法检测细胞增殖情况;Transwell细胞迁移检测细胞的迁移能力;流式细胞仪检测细胞凋亡情况。2.转染组小鼠在构建心梗模型前注射入miR-125b antagomir,构建小鼠急性心肌梗死模型,观察心肌梗死后心肌组织形态和SFRP5表达情况。结果:1.实时荧光定量PCR检测显示,转染miR-125b抑制物后,SFRP5表达上调(P<0.05);转染miR-125b模拟物后,SFRP5表达下调(P<0.05)。2.Western blot检测显示,转染miR-125b抑制物后,SFRP5表达上调,转染miR-125b模拟物后,SFRP5表达下调(P均<0.05);转染SFRP5过表达载体后,SFRP5表达上调,α-SMA表达受到抑制(P<0.05);转染SFRP5siRNA后,SFRP5表达下调,α-SMA表达水平则明显提高(P<0.05);转染SFRP5过表达载体后,Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达显著降低(P均<0.05);转染SFRP5siRNA抑制SFRP5表达后,Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达水平显著上调(P均<0.05);同时转染SFRP5过表达载体和miR-125b模拟物时,SFRP5表达上调不显著,α-SMA、Ⅰ和Ⅲ型胶原的表达并未受到明显抑制。3.BrdU增殖检测显示,转染SFRP5 siRNA下调其表达后,CFs细胞增殖得到促进(P<0.05);转染SFRP5过表达载体后则与miR-125b抑制物有类似作用,可以抑制CFs细胞增殖(P<0.05);共转染SFRP5过表达载体和miR-125b模拟物时,CFs细胞增殖同样受到抑制,但与空白对照组差异并不显著。4.Transwell细胞迁移检测显示,转染SFRP5 siRNA抑制其表达,可以增强CFs细胞迁移能力(P<0.05);转染SFRP5过表达载体则可以抑制CFs细胞迁移能力(P<0.05);共转染SFRP5过表达载体和miR-125b模拟物时,CFs细胞迁移下下调,但与对照组差异无统计学意义。5.流式细胞仪检测细胞凋亡显示,转染SFRP5过表达载体可显著上调CFs细胞凋亡(P<0.05);转染SFRP5siRNA则有相反作用;共转染SFRP5过表达载体和miR-125b模拟物时,CFs细胞凋亡有所上调,与对照组差异不显著。6.HE染色显示,假手术对照组可见心肌横纹清晰,排列整齐,细胞核明显,细胞无明显肿胀;急性心肌梗死组可见多发散在的坏死灶,界限清晰,可见有明显的成纤维细胞增生,心肌肥大,同时可见较多的纤维化;转染入miR-125b抑制物后,急性心肌梗死的典型病理现象有所改善。7.Masson染色显示,假手术组心肌组织被染成均匀红色,可见前壁的厚度较一致,心肌组织胶原纤维少,无条索状及融合的胶原纤维;急性心肌梗死组小鼠左心室前壁心肌梗死区心肌组织被胶原纤维取代,且显著增多,呈条索状,分割包绕心肌束,部分胶原纤维融合,并可见前壁变薄;急性心肌梗死组+ miR-125b抑制剂转染组可见急性心肌梗死后典型病理现象改善。IPP6.0分析比较各组Masson染色结果并计算胶原容积积分进行比较,急性心肌梗死组胶原容积积分明显高于假手术组(P<0.05),急性心肌梗死+miR-125b抑制剂转染组胶原容积积分明显低于急性心肌梗死组(P<0.05)。8.免疫组化染色后显示,SFRP5在假手术组小鼠心肌组织具有较高的表达;与假手术组比较,急性心肌梗死组心肌组织SFRP5表达显著下调(P<0.05);急性心肌梗死+ miR-125b抑制剂转染组心肌组织SFRP5表达明显高于急性心肌梗死组(P<0.05)。结论:1.SFRP5抑制CFs的合成胶原、向肌成纤维细胞分化、增殖及迁移能力。2.miR-125b通过抑制SFRP5,增强CFs合成胶原、向肌成纤维细胞分化、增殖及迁移能力。3.抑制miR-125b表达可以改善急性心肌梗死后心肌组织形态的病理改变。总结论:1.miR-125b促进CFs合成胶原、向肌成纤维细胞分化、增殖和迁移能力,抑制miR-125b表达可促进细胞凋亡;2.SFRP5抑制CFs合成胶原、向肌成纤维细胞分化、增殖及迁移能力,强化SFRP5表达可促进细胞凋亡;3.miR-125b通过抑制SFRP5,增强CFs合成胶原、向肌成纤维细胞分化、增殖及迁移能力;4.抑制miR-125b表达可以改善急性心肌梗死后心肌组织形态改变。