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谷胱甘肽 S-转移酶(Glutathione-S-Transferase,GSTs)是一组具有多种生理功能的二聚体蛋白超基因家族酶系，GSTs能催化还原型谷胱甘肽的巯基结合到疏水的化合物上，使其失去结合DNA的活性，亲电子物质变成亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，通过这种方式将体内、外源性化合物，如致癌物、断裂剂产生的亲电子物质、有潜在毒性的物质及亲脂性化合物等降解排除。因此GSTs在机体转化有毒化合物、保护细胞免受急性毒物攻击且在抑制细胞癌变中发挥重要作用。已有证据表明，某些GSTs活性的丧失与肺癌、头颈部、膀胱和结肠癌的高频发生成正相关。GSTPi是GSTs超基因家族中π家族的成员，在肺脏的含量尤为丰富。由于GSTPi对芳香族化合物具有高降解活性，在解毒致癌原、预防癌肿发生过程中的重要作用，与毒理学、职业肿瘤及肺癌存在密切关系。 本研究用RT-PCR技术从人胎盘组织获取人谷胱甘肽硫转移酶Pi(GSTPi)基因的cDNA序列，将其扩增产物GSTPi基因插入到原核克隆载体pMD18-T中，用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒pMD18-T-GSTPi进行鉴定，将测序正确的GSTPi基因连接到表达载体pMAL-c2x多克隆位点中，构建重组表达质粒pMAL-c2x-GSTPi，鉴定后，用IPTG对重组子JM109(pMAL-c2x-GSTPi)进行诱导表达，表达产物用麦芽糖亲和层析法纯化。 本研究旨在克隆人GSTPi基因并建立体外GSTPi代谢解毒酶基因表达菌株JM109(oMAL-c2x-GSTPi)，获取并纯化GSTPi蛋白，为研究GSTPi真核细胞表达，研究真核细胞中GSTPi酶抗细胞毒性作用、抗细胞恶性转化活性作用和肿瘤药物耐药性奠定基础，为毒理学、肿瘤的化学预防研究提供应用基础。郑州大学硕士学位论文人谷肤甘肤硫转移酶Pi基因的克隆及其蛋白的表达和纯化 实验方法:1.总RNA制备及RT-PCR扩增 RNA提取按助eas严Mini kit方法制备，RNA溶于20ulDEPC处理的ddHZO水中，用AMV以随机引物逆转录cDNA，再以cDNA为模板，用特异性引物、高保真几q DNApolymerase和LA Taq DNA polymerase pCR扩增GSTpi基因;扩增产物用1 .20，0琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。2.目的基因与克隆载体的连接及鉴定 将扩增的hGSTPi基因与克隆载体pMD18一T-Teasy按照合适的比例混合，加入T4连接酶，在16℃恒温连接仪中连接，将上述混合液转化大肠杆菌JM109，阳性克隆通过氨节青霉素抗性和蓝白菌落筛选初步确定，白菌落经PCR扩增目的基因及小提质粒酶切 (Eco班、Sall)出目的基因进一步鉴定重组质粒。3.目的基因的序列测定与分析 目的基因的序列测定由上海基康生物公司DNA序列分析226025.HT7，并通过DNAsis2.5与GeneBank中的已提交序列进行分析和比较。4.目的基因与表达载体的连接及鉴定 从测序正确的重组pMD 18一T-Teasy质粒中纯化hGSTPi基因片段，定向插入到原核表达载体pMAL一cZx中，转化大肠杆菌JM 109，37℃，12h氨节青霉素抗性(LA)固体培养基培养，阳性克隆通过蓝白菌落筛选初步确定，白菌落进一步经PCR扩增及质粒酶切(Eco租、Sall)进一步鉴定是否为重组质粒。5.pMAL一cZx一GsTPi的表达、产物鉴定及纯化 将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌JM109，经IPTG，37℃诱导，收集不同时间段的菌液，变性处理后，进行SDS一队GE电泳，与蛋白Marke:参比，观察有无目的蛋白表达;菌液上清通过与GSTs特异性底物1一氯一2，4一二硝基苯(DCNB)反应，测定其酶活性。将表达的蛋白产物与兔抗人的GSTPi单克隆抗体进行W七stem blot杂交分析，鉴定表达的产物是否GSTPi蛋白;大量诱导pMAL·cZx一GSTPi，超声破碎全菌并离心，分别处理上清和沉淀，SDS一队GE电泳后，观察诱导蛋白产物在上清和沉淀中的表达量，如果主要在上清液，可直接经麦芽糖亲和层析法纯化，如果主要在沉淀中以包涵体形式存在，先处理包涵体再纯化。郑州大学硕士学位论文人谷胧甘肤硫转移酶Pi基因的克隆及其蛋白的表达和纯化结果与分析:1.总RNA的提取和GSTPi基因的扩增 胎盘组织约30mg提取总RNA，电泳结果显示提取总RNA呈现285、185，见图1紫外测定表明AZ。/A280>1 .8，说明提取总RNA完整且纯度符合反转录要求。GSTPi基因的扩增见1.2%琼脂糖凝胶电泳显示:以cDNA为模板扩增出单一特异性条带，大小位于600一700bp之间，与预期0.63kb分子大小一致。表明己获得人GSTPi基因。2.pMD18一T-GsTPi重组质粒的构建与鉴定 GsTPi基因和pMD 18一T经过连接，转化，涂板，挑取菌落，提取质粒，经筛选得到重组质粒pMn 18一T一GSTpi基因;pMD18一T一GSTpi基因经EeoRI单酶切和EcoRI、Sall双酶切，获得约3.3kb和2.7kb，0.63kb片段，以重组质粒为模板进行PCR扩增，得到与目的基因片段大小相同的电泳条带。表明己获得GSTPi基因重组质粒。3.测序 将克隆的pMD 18一T-GSTPi基因测序，由起始密码ATG到终止密码TAG止，扩增得到的目的基因片段具有完整的阅读框。将测序结果输入GenBank，经BLAST软件分析，与人GSTPi基因(Gl:BC010915)eDNA序列进行比较，同源性达到100%。4.pMAL一cZx一GsTPi重组质粒的构建与鉴定 将重组质粒pMD18一T一GSTpi和pMAL一eZx?