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目的:1.提高梅花鹿鹿茸提取物的提取效率,高效利用鹿茸药材。2.为鹿茸的合理开发及科学利用提供新的方向。3.通过对鹿茸提取物的研究为鹿茸质量研究提供实验依据。材料与方法:1.本研究以梅花鹿鹿茸为研究对象,采用本课题组鹿茸多糖最佳提取工艺的参数制备多糖提取物,将提取多糖剩余的药渣作为提取多肽的原料,通过酶解法进行提取,采用响应面法对多肽酶解体系的酶解温度、p H、加酶量、时间等因素进行考察,以多肽含量为评价指标优化鹿茸多肽酶解工艺,利用膜分离技术,选用5k Da的超滤膜对酶解液进行分离纯化,经冷冻干燥后得小分子多肽冻干粉即为多肽提取物,为后期实验提供物质基础。2.从多肽提取物入手,采用三（羟甲基）甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE）分析技术,通过考察不同分离胶浓度以确定最佳电泳条件,对分离纯化后的多肽提取物的分子量分布进行检测,同时运用高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）通过对色谱柱、检测波长、流动相的考察确定HPGFC的色谱条件,利用卵清蛋白、细胞色素C、胰岛素和杆菌肽四种标准品的相对分子质量对数与色谱峰的保留时间的关系,绘制标准曲线,计算分子量大小,确定鹿茸多肽提取物分子量的分布情况;最后利用福林酚法测定多肽提取物中多肽的含量,以期为梅花鹿鹿茸多肽提取物的质量研究提供实验依据。3.从多糖提取物入手,经过Sevage法除蛋白、H2O2脱色后得精制多糖,通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）试剂进行柱前衍生化并进行HPLC分析,测定多糖提取物的单糖组成以及含量,再采用苯酚-硫酸法测定多糖提取物中多糖的含量,以期为梅花鹿鹿茸多糖提取物的质量研究提供实验基础,为中药质量评价提供依据。结果:1.通过对多肽酶解体系的酶解温度、p H、加酶量、时间等因素的考察确定以酶解温度、p H、加酶量建立三因素三水平的响应面实验设计,以多肽含量为评价指标优化鹿茸多肽酶解工艺。鹿茸多肽的最佳酶解工艺为:酶解温度为50℃,p H8.0的条件下,加入3.5%的碱性蛋白酶反应2h。2.采用水提醇沉法得到黄色多糖粉末即为多糖提取物,其药渣通过最佳酶解工艺提取再经超滤、冷冻干燥后得到棕色多肽冻干粉即为多肽提取物,多糖提取物的得率为8.020%,多肽提取物的得率为26.64%。经验证:多糖提取物的平均得率为8.264%,多肽提取物的平均得率为26.16%。3.通过考察分离胶的浓度确定三（羟甲基）甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE）条件,通过肽标准品的分子量范围5～245k Da的蛋白marker确定多肽提取物的分子量分布,结果显示经过超滤的多肽提取物分子量分布在15k Da以下,且经过超滤比未经过超滤多肽提取物少了两条25k Da和63k Da左右的条带,说明超滤可有效截留大分子。4.通过对色谱柱、检测波长、流动相的考察确定HPGFC的色谱条件为:（色谱柱:COSMOSIL 5Dio L-120-II（7.5mm×300mm,5μm）流动相:磷酸盐缓冲液（p H 6.5）,波长:220nm,流速1.0ml/min,柱温:30℃,进样量:10μl。）以卵清蛋白、细胞色素C、胰岛素和杆菌肽四种标准品配制成的混合对照品中各物质相对分子量的对数与色谱峰的保留时间的关系绘制标准曲线,利用标准曲线:log（MW）=-0.245t+6.8135（r=0.9721）计算分子量。结果测得未经过超滤存在60k Da和40k Da的大分子,经过超滤的多肽分子量广泛分布在1.6k Da-7k Da范围内,占整个峰面积的81.814%,表明超滤可有效过滤多肽大分子。5.以牛血清白蛋白为蛋白标准品溶液采用福林酚法测定多肽提取物中多肽的含量,以标准溶液质量浓度（C）与其相对应的吸光度（A）计算线性回归方程,得到的标准曲线为A=2.3663C+0.0529（r=0.9994）,精密度、稳定性、重复性试验的RSD值均小于2.0%,加样回收率在96.16～101.2%之间,RSD值小于2.0%。此方法测得多肽提取物中多肽的平均含量为470.0mg/g。6.采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化进行HPLC分析,多糖提取物中的单糖组成按照保留时间前后分别为甘露糖、盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、盐酸氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖,此七种单糖得到了完全分离,含量由高到低分别是甘露糖>葡萄糖醛酸>盐酸氨基葡萄糖>盐酸氨基半乳糖>葡萄糖>半乳糖醛酸>半乳糖。甘露糖、盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸为鹿茸多糖的主要组成单糖;半乳糖醛酸、盐酸氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖四者含量较为接近。7.以葡萄糖为标准品溶液采用苯酚-硫酸法测定多糖提取物中多糖的含量,以葡萄糖含量（mg）为横坐标,吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程:y=8.563x+0.0389（r=0.9997）。精密度、稳定性、重复性试验的RSD值均小于3.0%,加样回收率在95.61%～102.5%之间,RSD值小于3.0%,此方法测得多糖提取物中多糖的平均含量为9.956mg/g。结论:1.鹿茸多肽的最佳酶解工艺为:酶解温度为50℃,p H8.0的条件下,加入3.5%的碱性蛋白酶反应2h。多糖提取物的得率为8.020%,多肽提取物的得率为26.64%。经验证:多糖提取物的平均得率为8.264%,多肽提取物的平均得率为26.16%。2.Tricine-SDS-PAGE法对于小分子多肽具有较好的分离率、准确性和直观性;HPGFC法更加的简单、快捷,两者均能证明超滤可有效截留大分子,同时可用于多肽分子量的分布情况研究。福林酚法测得多肽提取物中多肽的平均含量为470.0mg/g。3.多糖的单糖组成由高到低分别是甘露糖>葡萄糖醛酸>盐酸氨基葡萄糖>盐酸氨基半乳糖>葡萄糖>半乳糖醛酸>半乳糖,柱前衍生化高效液相色谱法具有准确、可靠、稳定性高特点。苯酚-硫酸法测得多糖提取物中多糖的平均含量为9.956mg/g,可用于鹿茸多糖的含量测定和质量控制。