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本论文利用唐鱼卵黄蛋白原启动子,构建了对雌激素刺激敏感的基因重组酵母测评系统AHptERα/pr2,建立了一种可用于检测环境雌激素的分子生物学方法,并对影响检测效果的因素进行了探讨。
首先,构建含有唐鱼卵黄蛋白原启动子的报告载体。从已知的3条启动子序列中挑选合适片段,以唐鱼全基因DNA为模板,设计特异性引物,PCR克隆出唐鱼卵黄蛋白原启动子promoter2片段,将其插入克隆载体pMD18T simplevector,测序结果表明成功获得启动子片段。将该片段插入pMP206 vector中,构建由唐鱼卵黄蛋白原启动子promoter2调控的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的雌激素作用报告载体pMP206/pr2。将该质粒转化大肠杆菌,对转化子进行PCR鉴定,发现有目的片段的特异条带,证实promoter2已重组于pMP206 vector中。
第二步,将雌激素受体(ERα)表达质粒pGADT7/tERα和卵黄蛋白原启动子报告质粒pMP206/pr2转入到酵母AH109中。经过筛选鉴定,发现有重组质粒的特异性条带,证实含有唐鱼雌激素受体完整开放阅读框序列(ORF)的表达载体和含有唐鱼卵黄蛋白原启动子(promoter2)的报告载体已经重组于该酵母细胞,环境雌激素重组酵母测评系统AHptERα/pr2构建成功。
第三步,用不同浓度的E2对分别含有表达质粒的酵母AHpGADT7/tERα、含有报告质粒的酵母AHpMP206/ERE、同时含有表达质粒和报告质粒的酵母AHptERα/pr2进行对比诱导,实验结果证明,酵母AHptERα/ERE能正确表达出tER蛋白,而且重组酵母的分子作用方式基本符合雌激素测评系统的设计思想和要求,该酵母在检测环境类雌激素污染物质的应用上具有一定的可行性。通过对影响该酵母敏感度的多种因素(接种初始密度、诱导时间、培养方法、显色方法)的比较和探讨,发现该酵母的最适测定条件为接种初始密度OD600为0.2～0.3,诱导时间控制在15～20小时以内时β-半乳糖苷酶酶活表达较好,使用96孔板培养显色误差值较小。