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胞质自由Ca2+是植物细胞普遍存在的第二信使,介导植物对体内外多种刺激产生相应反应。细胞质膜钙通道介导的Ca2+向胞质的转运对于胞质钙信号产生至关重要,因此,对植物细胞质膜钙通道进行研究并了解其调控机制,对于植物细胞信号转导网络研究具有重要意义。
作为一种重要植物激素,茉莉酸(JA)在调控植物对昆虫侵害、病原菌侵染的抗性方面起必不可少的作用。有研究表明,JA通过触发[Ca2+]cyt升高而调节细胞的生理生化反应。植物的环核苷酸离子通道(CNGC)是细胞质膜上的非选择性配体阳离子门控通道,可以非选择性的转导Na+、Ca2+和K+。为探究植物CNGC在JA信号通路中的作用,本论文进行了以下研究:
(1)以表达拟南芥ATCNGC2的酵母突变体trk1,2为实验体系,利用该体系证明cAMP调控ATCNGC2。研究表明,外源cAMP对表达ATCNGC2的酵母突变体trk1,2生长影响显著,证明了我们的推断。
(2)用两步酶解法提取拟南芥保卫细胞原生质体。首先使用作用比较缓和、浓度为0.8%的绿木酶Cellulysin25℃、120 r/min水浴振荡30 min,促使原生质体游离出来;然后再使用1.5%的纤维素酶Cellulase RS和0.02%的果胶酶Y-23组成的酶解液,22℃、60~70 rpm,酶解40~60 min,制备拟南芥保卫细胞原生质体。结果表明,两步酶解法可以制备出活性较高、适于进行膜片钳等后续试验的原生质体。
(3)以拟南芥叶片和保卫细胞原生质体以及酵母原生质体为实验材料,采用4℃低温导入2h,室温(20℃)避光孵育2h,完成Fluo3/AM对拟南芥叶片和保卫细胞原生质体的装载;28℃孵育2h,室温(20℃)避光静置2h,完成酵母原生质体的Fluo3/AM的装载。
(4)以提取的拟南芥突变体dnd1总RNA为模板,RT-PCR扩增获得VSP2基因片段,连接到PMD19-T克隆载体并测序鉴定。应用生物信息学方法分析VSP2基因的序列同源性。结果表明,克隆的VSP2基因片段与GenBank中VSP2基因序列同源性达到99%。