【摘 要】
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目的 通过基因工程技术在大肠杆菌中高效表达rhBMP-4，并经变性、复性后，获得具有生物活性的rhBMP-4，以期广泛应用于科研及临床研究。 方法 为获得目的蛋白在大肠杆菌中的高效表达，在不改变氨基酸序列的前提下，以全基因合成的方式对人BMP-4成熟肽基因全长进行定点突变，然后重组入pET-3c表达载体并转化至大肠杆菌DH5α中。经过PCR和双酶切鉴定后，将阳性转化子转化入BL2
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目的 通过基因工程技术在大肠杆菌中高效表达rhBMP-4，并经变性、复性后，获得具有生物活性的rhBMP-4，以期广泛应用于科研及临床研究。 方法 为获得目的蛋白在大肠杆菌中的高效表达，在不改变氨基酸序列的前提下，以全基因合成的方式对人BMP-4成熟肽基因全长进行定点突变，然后重组入pET-3c表达载体并转化至大肠杆菌DH5α中。经过PCR和双酶切鉴定后，将阳性转化子转化入BL21（DE）plysS中，随机筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达，然后选择表达量高的转化子送测序鉴定。将测序正确且表达量相对最高的重组转化子命名为大肠杆菌GSH菌株。随后对GSH菌株的发酵条件进行优化探讨，以获得适合该菌株生长与生产目的蛋白的最适条件。GSH菌株经IPTG诱导表达重组人骨形成蛋白-4和包涵体复性后，利用HPLC C8反相色谱柱对比rhBMP-4与hBMP-4标准品，然后利用western blotting、C2C12细胞横向成骨细胞分化实验以及小鼠肌袋异位骨形成实验检测其活性。 结果 成功构建了高效表达rhBMP-4的工程菌株，rhBMP-4的表达量最高可达细胞总蛋白的33.8％，表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在，经初步纯化及复性后，复性效率为32.8％，并经体外与体内的活性检测表明rhBMP-4有良好的诱骨生成活性。 结论 该方案能够实现rhBMP-4在大肠杆菌中的高效表达，为进一步研究奠定了基础。
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