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近年来,青枯病对蚕桑产业造成严重危害,对其致病菌桑青枯菌的早期检测和新型防治药剂研发势在必行。本文开发桑青枯病DAS-ELISA检测试剂盒,最低检测限为3.13×10~3 CFU/mL,检测时长为2.5 h。制成复方咖啡酸甲酯与咖啡酸苯乙酯的PLGA纳米药剂,半抑制浓度达到0.285 mg/mL,抑制效果好、药量减少2/3;缓释性能良好,桑青枯菌的致病力相关基因phcB、egl、pehC和phcA等下调1/42至1/2不等。主要结论如下:(1)构建了特异性结合力强的桑青枯菌单克隆抗体利用免疫学和血清学技术,使用活体菌株对小鼠进行免疫处理,获取脾脏细胞用于构建杂交瘤,制备出三种特异性的单克隆抗体1G9、2H5和9G9。经抗体亚型鉴定,三种抗体均为IgG1型。使用辛酸硫酸铵法对抗体纯化,采用间接ELISA法测得三种单克隆抗体对桑青枯菌特异性结合力强,效价均达到1:64000。(2)构建了桑青枯菌快速高灵敏度的DAS-ELISA检测方法使用免疫PCR法对制备的1G9、2H5、9G9和多克隆抗体(Polyclonal Antibody,PcAb)进行特异检测,并评价四种抗体对青枯菌的特异性结合能力。采用hrp标记抗体制备酶标抗体用于构建桑青枯菌DAS-ELISA方法,并对其使用的捕获抗体、酶标抗体、封闭液浓度和酶标抗体稀释倍数进行筛选,结果表明:以1G9为酶标抗体,1G9、9G9和PcAb分别为捕获抗体,使用1%脱脂牛奶作为封闭液,酶标抗体稀释倍数为1:500,此时对模拟土壤样品中桑青枯菌的最低检测限为3.13×10~3 CFU/mL,检测时长为2.5 h。(3)制备了抑制桑青枯菌的复方PLGA纳米药剂颗粒制备的纳米药剂颗粒抑制效果显著。采用单乳液溶剂挥发法制备咖啡酸甲酯和咖啡酸苯乙酯的复方PLGA纳米颗粒,对PVA稳定剂浓度、超声功率、超声时间以及有机相水相比例进行条件优化,采用FT-IR、粒度分析仪对药剂表征。在优化条件下,获得载药率(28.33±0.03%)的PLGA纳米颗粒,水合粒径平均为188.86 nm,该纳米药剂颗粒对桑青枯菌的抑制效果好(半抑制浓度0.285 mg/mL,可使青枯菌表面产生明显孔洞),同时用药量减少2/3。制备的纳米药剂颗粒缓释性能良好。使用Fickian模型对载有MC和CAPE的复方纳米药剂颗粒进行动力学分析,在pH为6.5、7.4和9.5的磷酸盐缓冲液中理论半衰期分别为10.0 d,5.8 d和5.7 d。另外,通过RT-PCR检测,发现复方纳米药剂处理24h后,桑青枯菌的致病力相关基因egl、pehC、phcA、phcB、pilT和polA-238的表达量分别下降至原料药(对照组)的1/6、1/13、1/2、1/42、1/2和1/8,从基因水平上证明了本研究制备的药剂抑制病菌致病力强。本研究使用DAS-ELISA构建的早期诊断方法和制备的纳米药剂,丰富了桑青枯病防治策略的新内容。