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GLP-1是由肠道L细胞合成和分泌的由30个氨基酸组成的多肽,它不仅能促进胰岛素合成,而且能够促进胰β细胞增殖和抑制胰β细胞凋亡。GLP-1独特的降血糖作用机制,是现有抗糖尿病药物无可比拟的,但由于其在体内的半衰期非常短,大大限制了其应用。为克服GLP-1半衰期短的缺点,实现其在体内的长效作用,本实验室成功构建了胰高糖素样多肽-1(GLP-1)突变串联体与人血清白蛋白的表达质粒pPIC9K/(GLP-1A2G)2-HSA,并且初步实现了在毕赤酵母KM71中的表达。在此基础上,本文主要围绕提高融合蛋白GGH的产量和分离纯化进行研究,主要结论如下:(1)统计分析了融合基因GGH在不同毕赤酵母宿主(KM71、GS115、SMD1168)中的表达,并通过荧光定量PCR研究了三株产量差异较大的GS115重组子基因剂量与融合蛋白GGH表达量的关系,实验结果表明:宿主GS115更有利于融合蛋白GGH的表达,融合蛋白的表达量与目的基因的剂量成正相关,最终确定高一株产菌株GS115/F2,在摇甁中的稳定表达量为328 mg/L。(2)研究了高表达菌株的发酵过程,确定了其在5 L发酵罐上的发酵工艺。实验结果表明有机氮源培养基更有利于融合蛋白GGH高密度表达及控制目的蛋白的降解;在有机氮源培养基中,0.5%的甲醇脉冲式流加方式和30℃诱导温度为最佳诱导条件,最终融合蛋白GGH的产量达到642 mg/L。(3)初步建立了融合蛋白GGH的分离纯化路线,即发酵液8000 r/min离心5 min, 10 kDa截留量的超滤膜超滤浓缩20倍, Blue Sepharose亲和吸附、Sephadex G25脱盐、Q Sepharose FF离子交换层析,整个纯化过程回收率为33.4%,经SDS-PAGE和HPLC检测纯度大于95%,符合下一步生物活性和药代动力学实验和药剂学试验的要求。