论文部分内容阅读
胰腺坏死（Pancreatic necrosis,PN）是急性胰腺炎（Acute pancreatitis,AP）最常见的严重局部并发症之一,亦是后续病情恶化的基础,严重影响AP患者的预后。近年来,越来越多的研究表明PN的发生可能与胰腺局部微循环血栓形成密切相关。以往关于血栓的大量研究阐明了血管性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）多聚体和ADAMTS13（A disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif,member 13）与微循环血栓之间的关系。vWF的最高活性形态UL-vWF（Ultra Large-von Willebrand factor）在血栓形成中发挥极为关键的作用,可直接介导自发性血小板黏附和血栓形成,而UL-vWF的活性受ADAMTS13调控,其可被ADAMTS13切割成小分子,变成较少黏附的血浆形态。因此,ADAMTS13活性水平异常降低是导致微循环血栓形成的潜在独立危险因素,其对vWF的调控作用可被认为是一种新型的抗血栓的治疗靶点。然而,vWF及ADAMTS13在AP中目前仍缺乏相关研究,因此,本课题通过以下两个部分探究其作用及可能的机制:第一部分vWF及ADAMTS13对于急性胰腺炎患者胰腺坏死发生及临床预后的早期预测作用研究目的:通过分析急性期入院AP患者vWF多聚体的分布以及ADAMTS13的活性,评价vWF及ADAMTS13与胰腺坏死及AP严重程度之间的联系。研究方法:2018年11月到2019年1月间所有发病7天内入我院的成人AP患者纳入本项研究。入院时即留取患者的血样,同时收集患者的相关临床资料直至出院。通过酶联免疫吸附测定以及琼脂糖凝胶电泳的方法检测血浆中ADAMTS13 活性、vWF 和内皮细胞蛋白 C 受体（endothelial protein C receptor,EPCR）浓度并与主要AP严重度相关指标进行比较,探究各指标与PN以及总体预后间的联系。结果:50例患者最终纳入研究,其中重型急性胰腺炎（Severe acute pancreatitis,SAP）20例（40%）。通过对AP患者的血浆进行vWF多聚体垂直电泳,可以看到随着病情严重程度的增加,vWF多聚体的含量显著增加,并在部分SAP患者中可检测到vWF的最高活性形态—UL-vWF,其裂解蛋白ADAMTS13的活性与AP严重程度以及CT严重程度评分（Computed Tomography severity index score,CTSI score）呈现显著的负相关性。在多因素logistic回归分析中可以发现,AD AMTS 13活性以及抗凝血酶-Ⅲ（antithrombin Ⅲ,AT-Ⅲ）的降低是广泛胰腺坏死（胰腺坏死>30%）的独立危险因素。ROC（Receiver Operating Characteristic）曲线分析结果显示,ADAMTS13活性预测胰腺坏死范围>30%的曲线下面积为0.899。结论:ADAMTS13活性与SAP和胰腺坏死范围>30%密切相关。vWF及其裂解蛋白ADAMTS13可能直接参与了胰腺局部微循环血栓的形成,进而促进胰腺组织坏死,加重AP的严重程度。第二部分ADAMTS13重组蛋白改善小鼠重症急性胰腺炎疾病严重程度及其机制研究研究目的:第一部分临床研究表明vWF及其裂解蛋白ADAMTS13可能参与了胰腺局部微循环血栓的形成,进而促进胰腺坏死的发生发展。因此,本部分为了进一步探究vWF及ADAMTS13对胰腺坏死形成的作用及机制,给予AD AMTS 13 人源重组蛋白（Recombinant human AD AMTS 13,rhAD AMTS 13）对SAP小鼠进行干预并观察。研究方法:选用8-10周龄左右C57BL/6小鼠18只,随机分为三组:阴性对照组、SAP组、SAP+rhADAMTS13（250ug/kg）组,每组6只。应用雨蛙素联合脂多糖腹腔注射方法建立SAP模型,于造模48小时后处死小鼠,留取相应标本。利用外周血,检测淀粉酶水平、vWF、ADAMTS13以及其他内皮损伤相关指标的表达。胰腺组织分别行苏木精伊红染色和纤维蛋白免疫组化染色,观察胰腺病理损伤与局部微血栓形成情况。结果:小鼠SAP造模后血浆中ADAMTS13浓度显著下降,伴随vWF水平显著升高,多聚体凝胶电泳显示SAP小鼠血浆中出现UL-vWF,而给予rhADAMTS13后SAP小鼠血浆中的UL-vWF消失,伴随vWF表达的显著下降,小鼠的胰腺坏死和胰腺局部微循环血栓显著改善。此外,rhADAMTS13还能下调SAP小鼠血浆中EPCR和P-选择素的水平,并且上调一氧化氮的水平,蛋白印迹分析提示rhADAMTS 13可提高Akt和内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）的磷酸化水平,提示其可能通过激活Akt通路改善内皮损伤。结论:研究表明rhADAMTS13可通过裂解vWF和减轻内皮损伤,减少胰腺局部微循环血栓形成,从而减轻胰腺坏死。