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日本血吸虫病是我国一种危害严重的人畜共患寄生虫病.由于中间宿主钉螺难以消灭,治疗药物吡喹酮不能解决重复感染难题,而且有可能诱导产生抗药性,因此有必要研制高效、安全的抗血吸虫病疫苗和新治疗药物.东方田鼠(Microtus fortis)是迄今为止在日本血吸虫病疫区发现的唯一一种感染血吸虫后不致病的哺乳动物,具有天然完全抗日本血吸虫病特性.作者曾利用重复攻击感染日本血吸虫尾蚴的东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA表达文库获得一个与曼氏血吸虫四跨膜蛋白SmTSP2基因同源性较高的EST序列.SmTSP2在小鼠曼氏血吸虫病模型中诱导了较高的保护效果.本文开展了日本血吸虫四跨膜蛋白SjTSP2研究.
1.利用获得的EST序列和RT-PCR技术成功扩增获得日本血吸虫SjTSP2基因(GenBank登录号EF553319),该基因ORF含776个碱基对,编码215个氨基酸.生物信息学分析表明,SjTSP2基因推导氨基酸序列的N端含有信号肽,并有4个跨膜区和2个膜外区,符合四跨膜蛋白家族的主要特征.该蛋白第二个膜外区(EM2)具有多个功能位点,与CD63同源,并有4个保守的半胱氨酸.抗原性分析表明SjTSP2蛋白EM2具有较强的抗原性.在此基础上,成功构建了含SjTSP2基因第二个膜外区的原核表达质粒SjTSP2EM2/pET28b和SjTSP2EM2/pGEX-4T-2,通过优化实验条件在 E.coli Rosetta(DE3) 中成功表达未降解可溶的融合蛋白SjTSP2EM2/HIS和SjTSP2EM2/GST,分子量分别为15KD和36KD,Western blotting分析表明融合蛋白具有较好的抗原性.
2.以看家基因α-tubulin为内参,应用荧光定量PCR技术分析了SjTSP2基因在日本血吸虫7d、14d和23d童虫及32d成虫体内差异表达情况.结果显示相对于每百万个α-tubulin转录拷贝,日本血吸虫7d、14d和23d童虫及32d成虫的转录数分别为18776、22999、18784、6195个拷贝,表明日本血吸虫SjTSP2基因在童虫中表达较高,在成虫中表达较低.应用免疫荧光技术进行组织定位分析,结果表明在血吸虫10童虫和44天成虫的体表均可见强烈的荧光信号,在虫体内部和消化道肠管中均未见明显的荧光信号.结果表明SjTSP2蛋白主要表达在血吸虫体被.
3.大量表达纯化rSjTSP2EM2/GST和rSjTSP2EM2/HIS重组蛋白,并免疫昆明系小鼠进行了二批免疫保护试验.结果与空白对照组相比,重组蛋白rSjTSP2EM2/GST在昆明系小鼠中分别诱导了25.78﹪和21.90﹪的减虫率,34.54﹪和42.67﹪的肝组织减卵率.重组蛋白rSjTSP2EM2/HIS诱导的减虫率为22.30﹪,差异不显著,但该蛋白诱导了较高的肝组织减卵率,达41.99﹪,差异极显著.用重组蛋白rSjTSP2EM2/GST和同属四跨膜蛋白的另一血吸虫蛋白Sj23的重组蛋白LHD-Sj23/GST联合免疫组小鼠后,诱导的免疫保护效果比单个重组蛋白均有较大提高,取得了37.43﹪的减虫率和45.27﹪的肝组织减卵率,和空白对照组比差异均极显著.应用ELISA方法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平变化,结果rSjTSP2重组蛋白免疫组小鼠在3次免疫后均产生了高水平的特异性IgG抗体,推测rSjTSP2诱导的保护作用可能与免疫鼠血清中高滴度的特异性IgG抗体相关.
本论文首次克隆了日本血吸虫四跨膜蛋白SjTSP2基因,通过生物信息学分析,详细预测了该蛋白的结构和功能.通过优化实验条件成功表达了未降解的可溶的SjTSP2重组蛋白.分析了SjTSP2基因在日本血吸虫不同发育时间的表达和观察了SjTSP2蛋白的组织定位.初步研究了SjTSP2重组融合蛋白的免疫保护效果并进行了机理探讨.本文较系统地开展了日本血吸虫四跨膜蛋白SjTSP2研究,对筛选血吸虫病疫苗新候选抗原分子具有重要意义.