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猪δ冠状病毒病主要由猪德尔塔冠状病毒（PORCINE DELTACORONAVIRUS,PDCOV）引起的一种肠源性、接触性、传染性疾病。各个日龄阶段的猪均易感,主要侵害5～21日龄的哺乳仔猪,仔猪感染后出现腹泻、呕吐等急性临床症状,死亡率高达100%。PDCOV感染后的临床症状、病理变化及流行病学与猪流行性腹泻病毒（PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS,PEDV）极为相似,且常发生混合感染,通过临床症状难以进行确诊,必须借助实验室检测方法才可鉴别诊断。核衣壳蛋白（NUCLEOCAPSID,N）是PDCOV的结构蛋白,且具有高度保守性,机体感染PDCOV后针对N蛋白产生的抗体最早,持续时间长,产生的抗体量也最多,N蛋白是建立免疫学方法的首选抗原。基于特异性单克隆抗体的免疫分析方法在建立特异性强、灵敏度高、重复性好的诊断试剂盒的应用上发挥重要作用,被广泛应用于疾病诊断、食品安全检测等领域中,当前国内外尚未有可用于猪δ冠状病毒诊断的商用试剂。因此,建立PEDV、PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR鉴别检测方法、基于重组N蛋白（R N）建立间接ELISA检测方法及研制抗PDCOV N蛋白的单克隆抗体对于PDCOV的临床诊断和防控具有重要意义。本研究建立了PEDV、PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR检测方法;将转化N蛋白基因进行重组融合表达和纯化,建立了基于重组N蛋白（RN蛋白）的间接ELISA抗体检测方法;以PEG 2000为融合剂将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,通过建立的间接ELISA抗体检测方法经过4～5次筛选得到阳性克隆,制备抗PDCOV N蛋白的单克隆抗体并进行鉴定。试验结果如下:1.PEDV、PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR方法的建立根据GENE BANK中收录的已知PEDV和PDCOV基因序列,用MEG ALIGN对PEDV M基因和PDCOV N基因进行比对分析,设计两对引物和TAQMAN-MGB探针对,优化最佳引物、探针浓度及反应条件,建立PEDV和PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验及临床实验,结果显示:PGEM-PEDV标准曲线的循环阈值（CT）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.998,拷贝数（X）与CT值之间的线性关系表达式为CT=﹣3.374 LGX+35.47;PGEM-PDCOV标准曲线的循环阈值（CT）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.998,拷贝数（X）与CT值之间的线性关系表达式为CT=﹣3.543 LGX+35.5。该方法对PEDV和PDCOV检出的灵敏度均可达101COPIES/μL,表明灵敏度高;该方法可特异性的检测出PEDV、PDCOV阳性样品,而对TGEV、SADS、PRO V阳性样品及PEDV、PDCOV阴性样品无特异性扩增反应,表明特异性强;该方法组内、组间重复性变异系数均小于1.5%,表明重复性好;用建立的该方法对临床90份小肠组织样品进行检测,结果显示:16份为PEDV阳性,15份为PDCOV阳性,PEDV和PDCOV双阳性为6份,而普通PCR检测出13份PEDV阳性,12份PDCOV阳性,PEDV和PDCOV双阳性为4份,表明建立的FQ-PCR方法检出率较普通PCR高。因此,本研究建立的PEDV和PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR检测方法可为以上两种疫病的快速检测诊断提供方法。2.PDCOV N基因的重组表达及基于RN蛋白间接ELISA检测方法的建立本研究将PDCOV N基因扩增并克隆到PET 32A（+）载体上,经过诱导表达、纯化得到RN蛋白。优化最佳包被条件、血清稀释度、封闭条件、二抗稀释度,建立基于R N蛋白的间接ELISA检测方法,经过特异性、敏感性、重复性及临床血清样品检测,结果显示:本研究成功扩增了长度1029BP N基因,表达的RN蛋白约为60K D,WESTERN BLOT结果表明该RN蛋白具有良好反应原性。RN蛋白最佳包被浓度为2μG/M L;血清最佳稀释度为1:100,作用时间1 H;羊抗猪HRP-IG G最适稀释度为1:5000,作用时间为30 MIN;TMB最佳显色时间为10 MIN。该方法可检出PDCOV阳性血清样品,而与TGEV、PRO V、SADS、PEDV阳性血清样品及PDCOV阴性血清样品无反应,表明特异性强;用建立的间接ELISA检测方法检出的5份阳性样品最高稀释倍数与中和实验基本相同,表明该方法敏感性好。批内、批间变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。选取临床92份血清样品与中和实验结果做比较,两者符合率为93.3%。因此,本研究通过重组表达PDCOV N蛋白建立基于RN蛋白的间接ELISA血清学检测方法,为PDCOV监测及临床诊断提供了灵敏、特异且高效的工具。3.PDCOV N蛋白单克隆抗体的制备本研究用灭活并纯化的PDCOV细胞培养毒为抗原免疫纯系BALB/C小鼠,通过杂交瘤细胞技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,用有限稀释法进行亚克隆并用建立的间接ELISA检测方法进行筛选,同时鉴定单抗亚型,最终筛选出1株亚型为IGG且能稳定分泌抗PDCOV N蛋白单抗的杂交瘤细胞株1A4。将杂交瘤细胞扩大培养,收集腹水后对其进行纯化,经过稳定性、特异性、阻断性检测,结果显示:1A4单抗特异性好,可特异性与PDCOV抗原反应,而与PRO V、PEDV、SVA、SADS、TGEV等抗原均不发生交叉反应;稳定性好,经过7次连续传代后,其效价依然可达到1:128000;有一定的阻断性,能够被PDCOV诱导的特异性阳性血清有效阻断。制备的抗PDCOV N蛋白的单克隆抗体,为进一步建立基于RN蛋白单抗的阻断ELISA及应用于临床快速检测的胶体金检测试纸条等方法奠定了基础。